qPCR y RT-qPCR
Los ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y RT-qPCR de Promega ofrecen la posibilidad de elegir entre métodos de qPCR basados en sondas o en dyes. También ofrecemos los reactivos XpressAmp™, compatibles con GoTaq® qPCR y RT-qPCR Systems, que permiten la amplificación directa por PCR a partir de muestras virales sin necesidad de realizar la extracción de ARN o ADN.
Tanto los ensayos de qPCR basados en sondas como los basados en dyes, proporcionan una detección sensible que permite una cuantificación reproducible y temprana de dianas de bajo y alto número de copias, en un amplio rango dinámico. Asimismo, son resistentes a una amplia gama de inhibidores de la PCR y proporcionan una detección sensible en la mayoría de los instrumentos de PCR en tiempo real, adaptándose a los métodos de ciclado rápido y estándar.
Todos los sistemas de qPCR y RT-qPCR también ofrecen la posibilidad de poder preparar las reacciones a temperatura ambiente, junto a formulaciones de master mix fáciles de usar.
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¿Qué es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)?
La PCR cuantitativa en tiempo real, o qPCR, es un método estándar para detectar y cuantificar una secuencia diana específica, o para cuantificar los niveles de expresión génica en una muestra. En qPCR, sondas o ácidos nucleicos marcados con fluorescencia, o dyes fluorescentes de unión a ADN doble hebra, son incorporados a la reacción de PCR y la formación del producto se monitoriza en tiempo real tras cada ciclo de PCR.
La qPCR basada en sondas utiliza un cebador o sonda fluorescente para detectar el producto de amplificación. La ventaja de este método es que permite la detección específica de la secuencia diana y reduce la probabilidad de detectar artefactos inespecíficos. La detección basada en sondas también permite la amplificación múltiple mediante el uso de sondas marcadas de forma diferencial. Hay varios enfoques diferentes para la detección de qPCR basada en sondas, incluyendo sondas de hidrólisis como TaqMan®, sondas de hibridación, sondas en forma de horquilla y cebadores marcados.
El uso de dyes fluorescentes de unión al ADN, como BRYT® Green o SYBR® Green, es uno de los enfoques más sencillos de la qPCR. El dye se añade a la reacción y la fluorescencia se mide en cada ciclo de PCR. Dado que la fluorescencia de estos dyes aumenta drásticamente en presencia de ADN de doble cadena, la síntesis de ADN puede monitorizarse con el aumento de la señal fluorescente.
El resultado principal de un experimento de PCR en tiempo real es la curva de amplificación, que muestra la acumulación del producto amplificado en forma de señal fluorescente con respecto al número de ciclos.
La cuantificación de la cantidad de material de partida se realiza mediante el ciclo de cuantificación (Cq, también conocido como Ct). Cq o Ct (ciclo umbral) es el ciclo de amplificación en el que la señal de fluorescencia detectada alcanza un umbral de amplificación en un pocillo. El umbral de amplificación se calcula a partir de la fluorescencia de fondo (background) correspondiente a las líneas de base de todas las curvas del grupo, y representa el punto en el que la señal del reportero es significativamente superior a los niveles de fondo. El valor de Cq es inversamente proporcional a la cantidad de molde inicial en la reacción y es una medida relativa de la concentración de la diana en la reacción de PCR.
