 dUTP nel DNA e attività delle DNA Polimerasi
Fosforilazione
dei prodotti di PCR
DNA e gruppo EME
Eparina
e inibizione della RT-PCR
Melanina
ed inibizione della PCR
Taq
per marcatura di sonde a DNA
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)
dUTP nel DNA e attività
delle DNA Polimerasi
I frammenti di DNA che contengono residui di Uracile inibiscono l'attività delle DNA
Polimerasi degli Archeobatteri, come la Pfu e la Pwo DNA Polimerasi, in
quanto formano uno stretto complesso non produttivo con il DNA contenente uracile.
Le DNA Polimerasi degli Eubatteri, come la Taq, la Tfl, and Tth,
invece, non sono inibite dagli stessi frammenti di DNA.
Lasken, R.S., et al., (1996). Archeobacterial DNA
Polymerase Tightly Bind Uracil-containing DNA. J. Biol. Chem. 217: 17692.
Fosforilazione
dei prodotti di PCR
Gli ioni Ammonio (NH4+) inibiscono l'attività della T4 Polinucleotide
Kinase.
D'altra parte alcuni buffer frequentemente usati nelle reazioni di PCR, contengono ioni
Ammonio (come ad esempio il buffer della Pfu). Ciò rende necessario pulire il prodotto di
PCR prima di procedere con l'uso della T4 Polinucleotide Kinase.
DNA
e gruppo EME
Durante l'isolamento di DNA da campioni di sangue
parzialmente lisato, secco o di non fresco isolamento, c'è il rischio di co-purificare il
gruppo EME insieme al DNA.
Ciò può provocare l'inibizione della reazione di PCR o di altre applicazioni successive
all'isolamento.
Un trattamento con perossido di idrogeno (seguito dalla precipitazione in etanolo) o
l'aggiunta di BSA al DNA isolato possono alleviare l'effetto inibitorio del gruppo EME.
Alkene A, (1996). Alkene A, (1996).
Hydrogen
Peroxide Decomposes The Heme Compound in Forensic Specimens and Improves the Efficiency of
PCR. BioTechniques 21,392
Eparina e inibizione della RT-PCR
L'Eparina, un comune anticoagulante usato nei
prelievi di sangue, è un noto per inibire le reazioni di RT-PCR.
Si ritiene che questo anticoagulante venga co-purificato con gli acidi nucleici e nessuno
dei metodi classici (la bollitura, purificazione da gel e precipitazioni in Etanolo
ripetute) è in grado di rimuovere tale effetto inibitorio.
Due metodiche utilizzabili per l'eliminazione della Eparina sono il trattamento con
l'Eparinasi (1) e la precipitazione dell'RNA con LiCl (2).
1.Beutler, E., et al.,
(1990). Interference of Heparin whit Polymerase Chain Reaction. BioTechniques 9:
166.
2. Jung, R., et al. (1997). Reversal of RT-PCR Inhibition Observed in Heparinized Clinical
Speciments.
BioTechniques 23: 24
Melanina ed inibizione della PCR
La Melanina viene spesso co-purificata con gli
acidi nuclei e rappresenta un contaminante in grado di inibire le reazioni di PCR e
RT-PCR. L'aggiunta di BSA (>25ug) alla reazione di RT-PCR (25ul) può risolvere
l'effetto inibitorio della Melanina (1).
L'aggiunta di BSA è in grado di risolvere effetti inibitori di molti altri comuni
contaminati, incluso il gruppo EME gli acidi tannici ed il Cloruro di Ferro (2).
1. Gianbernardi, T., et
al., (1998). Bovine Serum Albumin Reverses Inhibition of RT-PCR by Melanin. BioTechniques
25(4): 564-566
2. Kreader, C., et al., (1996). Relief of amplification inhibition in PCR with Bovine
Serum Albumin or T4 gene32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1102-1106
Taq per marcatura di sonde a DNA
La Taq DNA Polimerasi può essere
utilizzata per produrre sonde a DNA marcate al 3' grazie alla sua attività di Terminal
Transferasi templato-indipendente che aggiunge residui di A al 3'.
La Taq DNA Polimerasi può essere anche utilizzata per "riempire" le
estremità 5' overhangs per generare sonda a DNA marcate al 5'.
Niedenthal, R. K. Et al., (1993).
An efficienty method to generate phosphatase insensitive 3' labelled DNA probes using Taq
DNA polymerase. Nuc. Acid Res. 21(18): 4413.
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)
La Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)
è spesso usata per amplificare il 5' terminale delle molecole di cDNA. Questo metodo
implica l'aggiunta di un coda omopolimerica o una sequenza adattatrice per permettere l'annealing
del primer al5' durante la PCR.
L'autoligazione o la formazione di concatameri dello stesso cDNA, può ovviare alla
necessità dell'aggiunta di una sequenza artificiale, permettendo l'uso di due primer
gene-specifici, rendendo la RACE una metodica meno laboriosa.
Eyal, Y., et al. (1999) Inverse
Single Strand RACE: An Adapter Indipendent Method or 5' RACE. Biotechniques 27:
656-658.
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