Reporter Assays für nukleare Rezeptoren

Anwender-freundlich Antibiotikaresistenzen auf allen Vektoren ermöglichen doppel-stabile Zellen	Weitere Informationen im Online-Shop »	interne Normalisierung Renilla Co-Reporter auf BIND-Vektoren
Vergleichbar eine Plattform für alle nuklearen Rezeptoren	Schnell kurze Induktionszeiten der Luciferase	Sensitiv besseres Signal-Rausch-Verhältnis durch 9x Gal4; kein Hintergrund durch endogene Expression
Protokoll ERα-Vektor (PDF) » Protokoll GR-Vektor (PDF) »

Nukleare Rezeptoren detektieren als Ligand-regulierte Transkriptionsfaktoren Steroide und andere Moleküle innerhalb der Zelle. Sie liegen im Cytoplasma meist im Komplex mit assoziierten Regulatoren vor. Bindet ein Ligand an den Komplex wandert dieser in den Zellkern. Dort bindet der Komplex mit seiner DNA-Bindedomäne (DBD) an spezifische DNA-Abschnitte. Dadurch wird das angrenzende Gen als Antwort auf die Anwesenheit des Liganden hochreguliert.

Der Luciferase-Reporterassay misst die zelluläre Aktivität der nuklearen Rezeptoren in Säugerzellen. In diesem System ist die Ligandenbindedomände (LDB) eines nuklearen Rezeptors mit der DBD des GAL4 Transkriptionsfaktors aus der Hefe fusioniert. Das Hybrid-Fusionsprotein bindet an die neun Wiederholungen der GAL4 Upstream Activator Sequence (UAS) und aktiviert den luc2P Luciferase-Reporter (Abbildung).

Folgende neue Vektoren kodieren Fusionsproteine für den Assay:

pBIND-ERα Vector (Kat.Nr. E1390): kodiert für ein Fusionsprotein aus der GAL4-DBD und der LDB des Östrogenrezeptor (ER-LBD).

pBIND-GR Vector (Kat.Nr. E1581): kodiert für ein Fusionsprotein aus der GAL4-DBD und der Glucocorticoid-Rezeptor-LBD (GR-LBD).

pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector (Kat.Nr. E1380): hat eine kodierende Sequenz für ein Fusionsprotein aus der GAL4-DBD, ein Linkersegment und eine in-frame Protein-kodierenden Sequenz mit den Schnittstellen SgfI 5‘ und PmeI 3‘. Das Fusionsgen wird vom Immediate-early-Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV) kontrolliert.

Alle Fusionproteine können bei Ligandbindung die Transkription der Luciferase induzieren. Dazu muss das Luciferase-Gen unter der Kontrolle einer GAL4 UAS stehen, wie z.B. im pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector (Kat.Nr. E1370) oder in den GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Zellen (Kat.Nr. E8530). Die destabilisierte und optimierte luc2P Luciferase ist sensitiver und benötigt kürzere Induktionszeiten als nativere Reporterenzyme.

Anwendungen:
- Charakterisieren von Liganden und Modulatoren nuklearer Rezeptoren
- Pharmaforschung/High-throughput Screening
- Krebsforschung
- Entzündungsforschung
- Umwelttoxikologie

 

Abbildung: Aktivierung des Luciferase-Gens durch Reporter-Assay

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