Promega GmbH

Funktionelle Gene erkennen und herausfiltern

Die Sequenzierung des menschlichen Erbguts ist weitgehend abgeschlossen. Nun gilt es, den rund drei Milliarden „Buchstaben“ des genetischen „Buches“, unseres Genoms, Funktionen zuzuordnen. Man schätzt, dass nur drei bis fünf Prozent der menschlichen DNA tatsächlich funktionelle Gene darstellen, der Rest ist größtenteils eine Art „Biomüll“. Mit der „in-vitro-Expressionsklonierung“ gelingt es, die echten Gene aus diesem Biomüll aussortieren.

 Als Präsident Bill Clinton im Juni 2000 bei einer Pressekonferenz die Lösung des genetischen Codes als wichtigsten wissenschaftlichen Meilenstein des vergangenen Jahrhunderts bezeichnete, standen zwei Männer mit ihm auf dem Podium vor dem Weißen Haus.
Die wissenschaftlichen Leiter zweier Genomprojekte J. Craig Venter, Präsident von Celera Genomics, und Francis Collins, Direktor des National Human Genome Research Institute, wurden für ihr erfolgreiches Bemühen, die drei Milliarden „Buchstaben“ des menschlichen Genoms nun bald buchstabieren zu können, geehrt.

Das Genom schreibt die Anleitungen für die Zusammensetzung des Proteingerüstes innerhalb jeder Zelle in jedem Gewebe des menschlichen Körpers. Dieses „Lebensbuch“ wird unweigerlich die Geheimnisse über Gesundheit und Krankheit preisgeben.

Die richtige Herausforderung beginnt aber erst jetzt. Die verkündeten Ergebnisse bieten gerade mal eine erste Grundlage für das eigentliche, ungleich schwieriger erreichbare Ziel: die Suche nach Medikamenten, mit denen Krankheiten geheilt, schädliche Vorgaben im menschlichen Erbgut ausgeschaltet und positive Erbeigenschaften herausgestellt werden können.

Genomik und Proteomik

Was die Forscher bis jetzt geleistet haben, sieht aus wie ein Text in einer fremden Sprache, in dem die Wörter nicht getrennt sind, Punkt wie Komma fehlen und Sätze durch lange Strecken scheinbar sinnloser Schriftsätze unterbrochen sind. Die Wissenschaftler sehen den genetischen Bauplan des Menschen, verstanden haben sie ihn noch nicht.

Viele Fragen über die Funktion individueller Genprodukte und ihre medizinische Bedeutsamkeit sind noch offen. Wissenschaftler wenden sich mittlerweile von der reinen strukturellen Genomik (die Entdeckung und Sequenzierung eines Gens) der funktionellen Zuordnung dieser genetischen Elemente zu, d.h. der Analyse von Expression, Struktur und Funktion der kodierten Proteine (Proteomik) (Abb. 1).

Abb.1. Genomik...zur funktionellen Genomik. >Für die Charakterisierung von Proteinen nach ihrer Funktion und für die Identifizierung der korrespondierenden Gene ist der kombinatorische Einsatz biochemischer und genetischer Methoden unabdingbar.

Dazu greifen die Genomforscher immer häufiger auf zellfreie in-vitro-Systeme zurück. Die in-vitro-Expression von Proteinen ergänzt die bisherigen Methoden, die sich rein auf die Analyse von DNA und RNA beschränken.

Vom Gen zum Phän in wenigen Stunden

Zwei Strategien sind möglich: (1) in vitro oder in vivo transkribierte mRNA dient als Ausgangsmaterial für eine Translationsreaktion im Lysat aus Kaninchenretikulozyten oder im Weizenkeimextrakt; (2) DNA wird direkt in Systemen eingesetzt, bei denen die Prozesse Transkription und Translation in einem Reaktionsschritt gekoppelt sind. Letzteres Vorgehen bildet die wissenschaftliche Grundlage für die TNT^®-Systeme der US-amerikanischen Firma Promega. Die DNA-Matrize kann entweder ein in ein Plasmid inseriertes Gen oder ein lineares PCR-Fragment sein.

Vor das unbekannte Gen ist idealerweise ein Promotor der Bakteriophagen T3, T7 oder SP6 geschaltet, da im TNT^®-System die Transkriptionsreaktion von der jeweiligen Phagen-RNA-Polymerase gesteuert wird. Nach Zugabe der DNA steht das gesuchte Protein bereits nach ein bis zwei Stunden für geeignete Darstellungsverfahren zur Verfügung.Seit ihrer Einführung 1992 werden die TNT^®-Systeme, Expressionssysteme auf der Basis von Retikulozytenlysat oder Weizenkeimextrakt, ständig weiter entwickelt. So gibt es seit einigen Monaten ein TNT^®-System, das speziell für PCR-Fragmente konzipiert wurde. Die jüngste Entwicklung auf diesem Gebiet ist das Gold TNT^®-T7 Express 96 SystemNT^®-T7 Express 96 SystemNT^®-T7 Express 96 SystemNT^®-T7 Express 96 System, das sich besonders für Anwendungen im Hochdurchsatzformat eignet. Es handelt sich dabei um präparierte Mikrotiterplatten, in deren 96 Vertiefungen jeweils alle erforderlichen Komponenten (bis auf die Ziel-DNA) für eine T7-gesteuerte, gekoppelte Transkriptions-/Translationsreaktion enthalten sind. Damit lassen sich in kürzester Zeit bis zu 96 DNA-Proben gleichzeitig analysieren.

Suche nach offenen Leserastern

Bei der Identifizierung unbekannter Gene steht zunächst die Frage im Vordergrund, ob und wo in dem untersuchten DNA-Bereich offene Leseraster (ORF’s), d.h. echte Gene, die für Proteine kodieren, vorkommen. Ein offenes Leseraster erkennt man an einem Initiationskodon am Anfang (meistens ATG, aber auch GTG), gefolgt von einer längeren Nukleotidsequenz, die für die entsprechende Aminosäuresequenz kodiert, und einem Terminationskodon am Ende (TAA, TAG oder TGA).

Über in-vitro-Expression können unbekannte cDNA-Klone auf das Vorhandensein offener Leseraster überprüft werden. Außerdem lassen sich damit anhand der DNA-Sequenz getroffene Vorhersagen bestätigen bzw. widerlegen. In beiden Fällen korreliert man Größe und Struktur der entstehenden Peptide mit Größe und Sequenz der korrespondierenden DNA.

Die natürliche Proteinstruktur stets im Blickpunkt

Die DNA- bzw. Aminosäuresequenz eines klonierten Gens gibt nur annähernd Aufschluss über das wirkliche Molekulargewicht des gesuchten Proteins. Diskrepanzen entstehen, weil in der Zelle die meisten Proteine während oder nach der Translation biochemisch modifiziert werden. Modifizierungen wie proteolytische Spaltung, die Anheftung von Zuckerresten, Lipiden, Phosphat- oder Adenylgruppen sind für Struktur und Funktionalität eines Proteins essentiell.

Wie kann man diese Prozesse in vitro „nachstellen“? In reinen Lysaten und in den TNT^®-Systemen finden praktisch alle Proteinmodifizierungen statt, die normalerweise zytosolischer Natur sind. In-vitro-synthetisierte Proteine werden an den dafür vorgesehenen Stellen beispielsweise phosphoryliert [1], adenyliert, oder proteolytisch gespalten [2]. Prozesse im endoplasmatischen Retikulum (ER), lassen sich durch Zugabe mikrosomaler Membranen - aus der Bauchspeicheldrüse von Hunden isolierte ER-Vesikel - imitieren. In Anwesenheit der Mikrosomen wird u.a. die aminoterminale Signalsequenz von Proteinen abgespalten [3], werden intra- und intermolekulare Disulfidbrücken gebildet und Glykosylreste auf das Protein übertragen [4].

An der Bildung der natürlichen Konformation eines Proteins sind in aller Regel intrazelluläre „Faltungshelfer“, sogenannte Chaperone, beteiligt. In den Lysaten/Extrakten und in den Mikrosomen, die bei der in-vitro-Expression eingesetzt werden, finden sich die Aktivitäten bekannter Chaperone, wie z.B. Vetreter der Hitzeschockprotein-(HSP)-Familie, Calnexin oder Proteindisulfidisomerase [5].

Zusammenspiel verschiedener Moleküle - Beispiele für Funktionsnachweise

Zellfreie Systeme eignen sich besonders, um potentielle Interaktionspartner des untersuchten Proteins zu identifizieren und dadurch auf etwaige Funktionen zu schließen. Interaktionspartner können entweder andere Proteine oder Nukleinsäuren (DNA oder RNA) sein.

Bei Protein/Protein-Wechselwirkungen dient die Methode häufig dazu, Ergebnisse, die mit in-vivo-Ansätzen erzielt wurden zu überprüfen, bzw. zu verifizieren (Abb. 2). Um eine Bindungsstelle zu definieren, setzt man gezielt Mutationen in die zu exprimierende DNA. Der Vergleich mit dem Wildtyp gibt Aufschluss über das Bindungsverhalten. Mit dieser Methode wurde z.B. untersucht, inwieweit die Wechselwirkung zweier Proteine Einfluss auf die Auslösung des programmierten Zelltods (Apoptose) nimmt [6].

Abb.2. Protein/Protein Wechselwirkungen. In vitro exprimiertes, markiertes Protein 1 interagiert mit Protein 2, das in vivo (in E.coli) exprimiert und über eine Säule aufgereinigt bzw. immobilisiert wurde. Erfolgreich eluierte Komplexe werden in der Gelelektrophorese analysiert.

In vitro-Expression ist bei der Suche nach Transkriptions- oder Translationsfaktoren, die an definierte DNA- bzw. RNA-Sequenzen binden, ebenfalls das Mittel der Wahl. Bindet das in vitro-synthetisierte Protein an die bekannte DNA/RNA-Sequenz, bleiben die gebundenen Moleküle in der Gelelektrophorese hinter den freien zurück (Electro Mobility Shift Assay, EMSA) (Abb. 3).

Rasches Screening ganzer cDNA-Banken - Das IVEC-Prinzip

Früher haben Forscher Proteine anhand einer bestimmten Eigenschaft oder Funktion langwierig aufgereinigt und das entsprechende Gen über mehrere Schritte (Proteinaufreinigung, Peptidsequenzierung, Isolierung der komplementären DNA) gewonnen. Das ist recht umständlich und zeitintensiv.

Im Labor von Marc Kirschner, einem Erforscher des Zellzyklus, sann man danach, die Auswahl biochemischer Methoden zur Charakterisierung von Proteinen auszuweiten, ohne dabei jedoch wieder auf komplexe Aufreinigungsmethoden zurückgreifen zu müssen. Die Forschungsgruppe entwickelte daher 1997 eine rasche in-vitro-Methode: IVEC (In Vitro Expression Cloning) [7].

Bei diesem Verfahren isoliert man von ausgewählten Zellen oder Geweben die RNA und schreibt diese mit Hilfe von oligo(dT)-Primern, die an proteinkodierende mRNA-Moleküle binden, zurück in die entsprechende zellspezifische cDNA (mRNA-basierende cDNA-Bank). Diese wird direkt in sogenannte „high copy“-Plasmide mit T3, T7 oder SP6-Promotor kloniert und anschließend in E.coli-Bakterien transformiert. Wenn die ausplattierten Bakterienkolonien die richtige Größe haben (1mm), werden jeweils 50 bis 100 davon als Pool zusammengefasst und einer Plasmid-DNA-Extraktion unterzogen. Diese Plasmid-Pools dienen direkt als Matrize für die Proteinsynthese im TNT^®-System. Abhängig von der Anzahl der cDNA-Moleküle mit vollständiger Länge werden 30 bis 50 verschiedene Proteine in einem einzigen Reaktionsansatz synthetisiert (Abb. 4).

Bei jedem Schritt wird ein Teil der jeweiligen Pools (cDNA, Bakterien, Plasmide, Proteine) für weitergehende Analysen zurückbehalten. Sollten sich etwa bei der ersten Analyserunde nur auf einer der Ausgangsplatten Kolonien mit vielversprechenden Kandidaten finden, wird man in den folgenden Untersuchungen auch nur auf diese Pools zurückgreifen und somit die Suche systematisch eingrenzen.

Die IVEC-Methode fand seit ihrer Entwicklung auf sehr verschiedenen Forschungsgebieten Anhänger. Man ist damit in der Lage, Substrate für definierte Enzyme oder auch DNA-bindende Proteine (z.B. Nachweis von Transkriptionsfaktoren über EMSA, s.o.) zu identifizieren. In einem typischen Reaktionsansatz werden die in-vitro-exprimierten Proteine mit einem entsprechenden Enzym (z.B. Phosphatase, Kinase oder einer Protease) inkubiert und über eine SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die potentiellen „Kandidaten“ lassen sich anhand ihrer elektrophoretischen Mobilität aufgrund veränderten Molekulargewichts im Vergleich mit der unbehandelten Probe heraus deuten (Abb. 4).

Kirschner und seine Kollegen suchten Substrate, die während der Mitose phosphoryliert oder abgebaut werden (Abb. 5). Sie haben die im TNT®-System synthetisierten Protein-Pools mit Extrakten von Zellen, die sich entweder in der Interphase oder in der Mitose befanden, inkubiert und anhand der Gelanalyse entsprechende Rückschlüsse ziehen können (Abb. 6). Es gelang damit, fünf neue Gene zu identifizieren, deren Genprodukte während der Mitose phosphoryliert werden [8].

Schematische Darstellung wie die Gruppe um M.Kirchner ausgehend von Interphase- und Mitoseextrakten aus Xenopus-Oozyten neue Zellzyklus-Proteine identifizierte.

Folge-Screenings als Kontrolle für die beobachteten Ergebnisse sind wichtig. Zum Nachweis von Kinasesubstraten behandelt man die Probe mit einer Phosphatase, was wieder zu einer Verringerung des zuvor erhöhten Molekulargewichts führen sollte. Potentielle Substrate von Proteasen wird man im Folge-Screen durch Inkubation mit Hemmstoffen der betreffenden Protease „überleben“ lassen.

 

Abb 6. Isolierung von mitotisch phosphorylierten und degradierten Proteinen durch IVEC. Protein-Pools wurden mit Interphase oder mitotischen Oozyten-Extrakten inkubiert und in der Gelelektrophorese analysiert. Pool (A) ist negativ; Pool (B) enthält ein Kinasesubstrat; Pool (C) enthält ein Proteasesubstrat.

 

Fazit

Die Tatsache, dass bei der in-vitro-Expression sowohl Reaktionsbedingungen als auch Endprodukte gezielt beeinflussbar sind, eröffnet für die Genomforschung völlig neue Ansatzmöglichkeiten. Faszinierend auch, dass mit der IVEC-Technologie die in-vitro-Expression von mRNA - in Form der korrespondierenden cDNA - Einzug in die Genomforschung gehalten hat. Die Methode ist daher bestens geeignet, um mehr über die Funktionen neuer Gene zu erfahren.

Der Vergleich des menschlichen Genoms mit dem anderer Organismen wird Biologen in aller Welt helfen, zu verstehen, wie komplizierte Wesen aus einfacheren entstanden sind, und welche Teile der genetischen Information ausschließlich humaner Natur sind. „Es muss ein Meilenstein in der menschlichen Geschichte sein, wenn man einen ersten Blick auf das Lebensbuch werfen kann,“ sagte einst James Watson, der zusammen mit Francis Crick vor etwa einem halben Jahrhundert die Struktur der DNA aufklärte. „Indes dieses Buch zu besitzen, wird die Welt verändern.“

&[1] Curran T., Gordon, M.B., Rubino, K.L., Sambucetti, L.C.: Isolation and characterization of the c-fos(rat) cDNA and analysis of post-translational modification in vitro. Oncogene. 1987;2(1):79-84.

[2] Bercovich Z. und Kahana C.: Involvement of the 20S proteasome in the degradation of ornithine decarboxylase. Eur J Biochem. 1993 Apr 1;213(1):205-10.

[3] Bulleid N.J., Curling E., Freedman R.B., Jenkins N.: Source of heterogeneity in secreted interferon-gamma. A study on products of translation in vitro. Biochem J. 1990 Jun 15;268(3):777-81.

[4] Marquardt T., Hebert D.N., Helenius A.: Post-translational folding of influenza hemagglutinin in isolated endoplasmic reticulum-derived microsomes. J Biol Chem. 1993 Sep 15;268(26):19618-25.

[5] Roy S., Sun A., Redman C.: In vitro assembly of the component chains of fibrinogen requires endoplasmic reticulum factors. J Biol Chem. 1996 Oct 4;271(40):24544-50.

[6] Chinnaiyan A.M., O’Rourke K., Tewari M., Dixit V.M.: FADD, a novel death domain-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis. Cell. 1995 May 19;81(4):505-12.

[7] King R.W., Lustig K.D., Stukenberg P.T.; McGarry T.J., Kirschner M.W.: Expression cloning in the test tube. Science. 1997 Aug 15;277(5328):973-4.

[8] Stukenberg P.T., Lustig K.D., McGarry T.J., King R.W., Kuang J., Kirschner M.W.: Systematic identification of mitotic phosphoproteins. Curr Biol. 1997 May 1;7(5):338-48.

[9] Haushalter K.A., Stukenberg P.T., Kirschner M.W., Verdine G.L.: Identification of a new uracil-DNA glycosylase family by expression cloning using synthetic inhibitors. Curr Biol. 1999 Feb 25;9(4):174-85.

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html updated 19-Jun-2007