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 Abstracts vorangegangener
Seminare
19.01.2006 in München
Inhibition of Interferon Pathways by Rabies virus
Krzysztof Brzózka, Stefan Finke, and Karl-Klaus Conzelmann
Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, LMU München, Germany
Interferon (IFN) and IFNare
important cytokines of the innate and adaptive immune response and are
crucial in clearance of viruses after infection. Using the dual luciferase
reporter system, we were able to show that in rabies virus (RV) infected
cells both production of IFN and the response
to IFN and IFN is
tightly controlled, enabling virus replication in infected host.
The IFN enhanceosome comprises AP1, NFB and
IRF-3 transcription factors. In order to investigate where the inhibition of
IFN production occurs, we used reporter plasmids encoding firefly luciferase
under control of different response elements along with renilla control
plasmids. This allowed us to localize the block in IFN induction on the
IRF-3 activation pathway. The response to secreted IFN involves binding to
its receptor and activation of JAK/STAT pathways. Different STAT homo- and
heterodimers stimulate production of a huge set of interferon stimulated
genes (ISGs) establishing powerful antiviral state. These genes are
controlled by specific promoter sequences, the interferon stimulated
response elements (ISRE), and the gamma activated sequences (GAS). Using
reporter plasmids in which firefly luciferase was controlled by either of
these sequences, we showed that RV infection inhibits transcription of ISGs
upon IFN treatment.
19.05.05 in Braunschweig
Inhibition of CRE/CREB-directed transcription by
the immunosuppressive drugs cyclosporin A and tacrolimus: use of
luciferase-reporter genes
E. Oetjen, K.-M. Thoms, Y. Laufer, D. Pape, R. Blume, P. Li, W. Knepel
Molecular Pharmacology, University of Göttingen,Germany
ICyclosporin A and tacrolimus are clinically important powerful
immunosuppressive drugs widely used after organ transplantation. The
ubiquitously expressed transcription factor CREB plays a pivotal role in
many and diverse functions among them T-cell development, activation and
proliferation. Phosphorylation of CREB on Ser-119 (in CREB-327), leading to
the recruitment of the CREB coactivator CBP is a prerequisite for
CREB-dependent transcription. Both immunosuppressants inhibit CREB-dependent
transcription through blocking calcineurin phosphatase activity without
decreasing phosphorylation of CREB on Ser-119. However, the molecular
mechanism remained unknown. Using transient transfections of luciferase
reporter genes into the electrically excitable pancreatic -cell line HIT,
the present study demonstrates that the transactivation domain of CREB is
sensitive to cyclosporin A treatment after membrane depolarization. Deletion
and mutation analysis indicated that as long as the transcriptional activity
of fragments is activated by membrane depolarization it is inhibited by
cyclosporin A. As revealed by a mammalian two hybrid assay the interaction
between CREB and CBP was not disturbed by cyclosporin A. The transcriptional
activity of CBP was decreased by cyclosporin A after membrane depolarization
thereby mimicking the CREB transactivation domain. Cyclosporin
A-responsiveness was mapped to the CBP N - (aa 1 to 450) and C- (aa 2040 to
2305) terminus. Both drugs inhibited membrane depolarization-induced CBP
C-terminus-dependent transcription with IC50 values consistent with the
reported IC50 values for inhibition of calcineurin activity, indicating that
calcineurin phosphatase activity contributes to the transcriptional activity
of CREB and its coactivator CBP. Thus, inhibition of CREB-directed
transcription through targeting its co-activator CBP may be a molecular
mechanism for the desired and undesired effects of cyclosporin A and
tacrolimus.
28.06.05 in Wien
Promotoranalyse in Mensch & Maus mitels Luciferase
Reportergenassays
T. Ohnesorg, GSF Neuherberg, Genome Analysis Center
Die Aufklärung der transkriptionellen Regulation eines Gens kann
wertvolle Hinweise auf dessen Funktion geben. Allerdings ist dieser
regulatorische Mechanismus bei eukaryotischen Genen meist sehr komplex, die
Analyse daher entsprechend aufwendig. Zur Charakterisierung der
Promotorregion(en) eines Gens stehen verschiedene Werkzeuge der
Bioinformatik zur Verfügung, mit denen jedoch keine endgültige Aussage über
die Funktionalität der identifizierten regulatorischen Sequenzen getroffen
werden kann. Aus diesem Grund müssen die bioinformatischen Ergebnisse
experimentell bestätigt werden. Zu diesem Zweck bieten sich u. a.
Zellkultur-basierte Luciferase-Reportergenassays an. Im Rahmen der
vorgestellten Arbeit wurden mit Hilfe des Dual Luciferase Assays die
Minimalpromotorregionen der humanen und murinen
17beta-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 7 lokalisiert. Zur genaueren Analyse
wurden mit diesem System zusätzlich die Auswirkungen verschiedener
Zusammensetzungen der Wachstumsmedien und der gezielten Veränderung mehrerer
Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen überprüft.
28.06.05 in Wien
Reportergenassays - Detektion auf
multifunktionellen Tecan Geräten
Dr. Gerlinde M. Zerza-Schnitzhofer, TECAN Austria Ges.m.b.H.
Der erste Teil befasst sich damit, wie Lumineszenzmessungen technisch in
zwei von unseren Geräten realisiert sind und was es zu beachten gilt. Der
zweite Teil zeigt Messungen zum Chroma-Glo™ Luciferase Assay System, die
gemeinsam mit Promega durchgeführt und in einer „Technical Note“
zusammengefasst wurden. Zum Abschluss werden noch Messungen mit dem
EnduRenTM Live Cell Substrate vorgestellt, die in den USA in automatisierter
Weise an Isoproterenol behandelten HEK Zellen durchgeführt wurden.
30.06.05 in Giessen
Isolation of RNA aptamers directed against HIV-1
envelope-derived surface epitopes
Ingrid Choi1, David Bunka2, Patricia Schult-Dietrich1, Gabriela Stiegler3,
Hermann Katinger3, Peter Stockley2, and Dorothee von Laer1
1Georg-Speyer-Haus, Institute for Biomedical Research, Frankfurt/Main,
Germany, 2Astbury Center for Structural Molecular Biology, University of
Leeds, UK, 3Institute for Applied Microbiology, University of Applied
Sciences, Vienna, Austria.
As the limitation of anti-HIV drug therapy becomes evident, alternative
therapeutic strategies are gaining interest. Peptides derived from the
heptad repeats of the HIV-1 gp41 envelope glycoprotein have shown a strong
potential to inhibit HIV-1 fusion and entry. However, the lack of
bioavailability, high production costs and the rapid emergence of resistant
virus strains still exclude a broad application. To overcome these
disadvantages, we have isolated RNA molecules which should interact with the
HIV-1 trimeric coiled coil structures, thus blocking membrane fusion.
Moreover, such RNA aptamers might support a guide through drug design.
The isolation of RNA aptamers was performed using the SELEX technology.
Several different HIV-1 gp41-derived peptides, either soluble or cell
membrane-anchored, served as targets in separate manual or robot-driven
selections. The starting DNA libraries contained a 30-nucleotide random
region flanked by defined primer binding sites. To ensure the selection of
biostable RNA aptamers, 2’-NH2-modified pyrimidines were included during all
in vitro transcription reactions.
After 10 rounds of selection, the analysis of individual sequences revealed
still rather heterogenous pools, in spite the presence of several common
sequence motifs. Furthermore, the individual RNA aptamers showed significant
differences in binding to the target peptide. The neutralising potential of
the RNA aptamers was analyzed by a single-round infection assay containing
luciferase as marker, revealing IC50 values of about 500 nM throughout the
different selections.
In order to increase the selection stringency, an affinity maturation step
is currently being established. In this setup, RNA pools should compete for
binding to their target structures with anti-gp41 monoclonal antibodies. In
preliminary experiments, the inhibitory capacity of a few individual
aptamers could be improved up to IC50 values of 250 nM.
Translationsregulation des Transkriptionsfaktors
NRF: Funktionelle Charakterisierung der 3´und 5´UTRs, Dr. Mahtab
Nourbakhsh, Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Molekulare
Pharmakologie
Der konstitutiv exprimierte Transkriptionsfaktor NRF unterbindet die
basale Expression einiger pro-inflammatorischer Cytokine durch eine direkte
und starke Protein-Protein-Interaktion mit NF-B. Zwei Transkripte
gewährleisten die Synthese des NRF-Proteins. Sie besitzen die gleiche
5´-untranslatierte und kodierende Sequenzen, unterscheiden sich aber in der
Länge der 3´-untranslatierten Region (UTR). NRF 5´-UTR enthält ein „Internal
Ribosome Entry Segment“ (IRES), das ursprünglich in den RNAs der
Picornaviren entdeckt wurden. IRES-Elemente ermöglichen die Translation auch
unter den Bedingungen, die eine Cap-abhängige Translation verhindern, wie
Apoptose, Mitose, Virusinfektion und Stress. Die relative Aktivität von
NRF-IRES ist bis zu 30fach stärker als die stärksten viralen IRES-Elemente.
Mit Hilfe von bicistronischen Vektoren und „Dual-Luciferase Reporter Assay
System“ wurden die mRNA-Sequenzen bzw. Strukturen, die für die IRES Funktion
wichtig sind, identifiziert. Die IRES-Aktivität lässt sich auf 150-200 Basen
einengen, die proximal zum authentischen AUG in NRF-mRNAs liegen. Es ist
allgemein bekannt, dass cis-agierende AU-reiche Elemente in 3´-UTR einiger
mRNAs die Translation regulieren. Die 3´-UTR von NRF enthält fünf
AUUUA-Motive, wovon zwei sich überlappen. Unsere Daten zeigen, dass die
längere NRF-mRNA viel stärker translatiert wird als die kurze mRNA ohne 3´
UTR. Wir vermuten, dass das 5´ IRES und die 3´UTR miteinander synergistisch
interagieren und damit die Translationseffizienz erhöhen. Unser nächstes
Ziel ist es, die Proteine zu identifizieren, die spezifisch an das
IRES-Element bzw. an 3´UTR binden und dadurch eine sehr starke
Cap-unabhängige Translationsinitiation ermöglichen.
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