Promega GmbH - Luciferase

Genetic reporter systems are widely used to study eukaryotic gene expression and cellular physiology. Applications include the study of receptor activity, transcription factors, intracellular signalling, mRNA processing and protein folding. The firefly luciferase gene is highly effective for this purpose because the luciferase assay is extremely sensitive, rapid, easy to perform and relatively inexpensive. Promega's Luciferase Assay Systems are substantially improved over conventional assay methods in both sensitivity and simplicity.

To improve experimental accuracy, dual reporters are commonly used. The term “dual reporter” refers to the simultaneous expression and measurement of two individual reporter enzymes within a single system. Promega's Dual-Luciferase^® Reporter (DLR^TM) Assay System provides an efficient means of performing dual reporter assays. In the DLR^TM Assay, the activities of firefly (Photinus pyralis) and Renilla (Renilla reniformis, also known as sea pansy) luciferases are measured sequentially from a single sample. Recently, Promega introduced the Renilla Luciferase Assay System, which provides an extremely sensitive, simple and rapid assay. The Renilla Luciferase Assay System with the new synthetic Renilla Luciferase Reporter Vectors can be used as a primary reporting system that yields up to 10x fold greater sensitivity than firefly luciferase systems.

For high throughput applications, where several multiwell plates are processed as a single batch, the signal stability of the standard luciferase reagents is insufficient having a half-life of approximately 5-10 minutes. Furthermore, maximum control of the assay environment requires removal of the growth medium prior to cell lysis, which is generally not practical for high-throughput applications using robotic systems. Promega`s Homogenous Luciferase Assay Systems, Steady-Glo™, Bright-Glo™ and the recently introduced Dual-Glo Reporter Assay System are particulary suited for researchers batch processing multiwell plates for high-throughput analysis. These assays yield a sensitive and quantifiable luminescent signal from the luciferase reporter upon addition of a single reagent directely into the culture medium containing the cells.

This presentation highlights the principles and features of each Assay system and introduces a variety of examples for possible applications.

Reportergen-Systeme finden bei der Erforschung der eukaryotischen Genexpression und der zellulären Physiologie ihren Einsatz. Mögliche Anwendungen liegen in der Analyse von Rezeptoren, Transcriptonsfaktoren, dem intrazellulären Signaling, dem mRNA Processing und der Proteinfaltung. Das Firefly Luciferasegen ist für die Verwendungen als Reporter bestens geeignet, da die Bestimmung des Luciferaseenzymes sehr sensitiv, schnell , einfach durchführbar und zudem kostengünstig ist. Das Luciferase Assay System von Promega ist in Bezug auf die Sensitivität als auch auf die einfache Handhabung konventionellen Assays weit überlegen. Um Reportergenanalysen noch genauer durchführen zu können werden heute häufig Dual Reporter Systeme eingesetzt. Der Ausdruck Dual Reporter bezieht sich auf die gleichzeitige Expression und Analyse zweier unabhängiger Reporterenzyme in einem Versuchsansatz. Promega’s Dual-Luciferase^® Reporter (DLR^TM) ermöglicht die sequentielle Bestimmung der Firefly-(Photinus pyralis) und der Renilla-(Renilla reniformis) Luciferase in einer Probe.

Das neue Renilla Luciferase Assay System ist ein sehr empfindlicher, dennoch einfacher und schneller Assay . In Kombination mit den neuen synthetischen Renilla Vektoren wirdbei der Anwendung als primäres Reportersystem eine bis zu 10fach höhere Sensitivität im Vergleich zu Firefly-Luciferase-Systemen erreicht.

Dr. Stefan Ries , MediGene AG, Martinsried: “Opposing Effects of Ras on p53: Transcriptional Activation of mdm2 and Induction of p19ARF”

Mdm2 acts as a major regulator of the tumor suppressor p53 by targeting its destruction. Here, we showthat themdm2gene is also regulated by the Ras-drivenRaf/MEK/MAP kinase pathway, in a p53-independentmanner. Mdm2 induced by activated Raf degrades p53in the absence of the Mdm2 inhibitor p19ARF. This regulatory pathway accounts for the observation that cells transformed by oncogenic Ras are more resistant to p53-dependent apoptosis following exposure to DNA damage. Activation of the Ras-induced Raf/MEK/MAkinase may therefore play a key role in suppressing p53 during tumor development and treatment. In primary cells, Raf also activates the Mdm2 inhibitor p19ARF.Levels of p53 are therefore determined by opposing effects of Raf-induced p19ARF and Mdm2.

Nadine Meindl, Institut für Pharmazeutische Chemie, Johann Wolfgang von Goethe Universität: "Stimulation der Genexpression durch RORa "

RORa (retinoid-related orphan receptor alpha) wird aufgrund seiner Struktur zu der Familie der Nukleären Hormonrezeptoren gezählt. Der Rezeptor wird als orphan receptor bezeichnet, da bislang kein physiologischer Ligand eindeutig bestimmt werden konnte. Es existieren die vier unterschiedlichen Spleißvarianten RORa1-4. Als Nukleärer Rezeptor ist RORa im Zellkern lokalisiert und ist dort als Transkriptionsfaktor in die Regulation der Expression zahlreicher Gene involviert. Der Einfluß auf die Promotoraktivität wird durch kurze, spezifische DNA-Bindestellen vermittelt, die als RORa response elements (RORE) bezeichnet werden. Durch Kotransfektion verschiedener Promotor-Luciferasegen-Konstrukte mit Expressionsplasmiden der RORa-Isoformen können über stimulierte Luciferase-Aktivitäten spezifische Effekte der Isoformen auf die Aktivität der Promotoren gezeigt werden. Durch Klonierung in Anzahl und Sequenz differierender ROREs vor den Promotor lassen sich eklatant unterschiedliche Spezifitäten der jeweiligen Isoformen definieren.

Kordula Kautz, Pharmazentrum Frankfurt, Klinikum der Johann Wolfgang von Goethe Universität: "Luciferase Reportergenassays als Testsystem für Triple-Helix-bildende Oligonucleotide"

Triple-Helix bildende Oligonukleotide (TFOs) besitzen die Fähigkeit, nach bestimmten Regeln an die DNA zu binden und bieten damit die Möglichkeit für sequenz-spezifische Interaktionen auf der DNA-Ebene. Durch die spezifische Bindung kann eine selektive Inhibition der Transkription einer Zielsequenz erreicht werden. Eine Möglichkeit eine stabile Triple-Helix Bildung zu zeigen bietet die Konstruktion eines Vektors mit einem Luziferase Reportergen und vorgeschalteter TFO Targetsequenz. Dazu wurde der pGL3-Kontroll Vektor mit den Restriktionsenzymen Hind III und Nco I geschnitten und mit einer 38 bp TFO Targetsequenz ligiert. Diese Sequenz stammt aus dem Promoterbereich des Chemokins MCP-1. In diesem Konstrukt liegt die Targetsequenz zwischen dem Luziferase Reportergen und dem SV 40 Promoter. In der lebenden Zelle kann ein TFO an diese Zielsequenz binden und eine Transkription des Luziferase Reportergens inhibieren. Ziel soll eine stabile Triple-Helix Bildung sein, die in einer Abnahme Luziferase Reportergenaktivität messbar ist.

Frank Gaunitz, Institut für Biochemie, Universität Leipzig: "Verwendung und Optimierung von Reportergen-Studien am Beispiel der Analyse der spezifischen Regulation des Glutamin-Synthetase-Gens"

Zur Untersuchung regulatorischer Ereignisse auf transkriptioneller Ebene entwickelten sich Transfektionsmethoden und die Anwendungen von Reportergenen in den letzten Jahren zu einem mächtigen Handwerkszeug, dessen sichere Handhabung eine große Zahl wissenschaftlicher Erkenntnisse gebracht hat. Obwohl die neuen Methoden von vielen Labors geplant werden oder bereits Verwendung finden, führen nicht selten Probleme unterschiedlichster Natur zu Frustration und Fehlergebnissen. Hierfür sind nicht selten schlechte Transfektionseffizienzen oder Promotorinterferenzen Schuld. Einige dieser Probleme lassen sich jedoch durch eine Optimierung der verwendeten Transfektionsprotokolle und durch andere Reportergenkonstrukte, bzw. Referenzplasmide lösen. Am Beispiel unserer Untersuchungen zur spezifischen Expression des Enzyms Glutamin-Synthetase in Zellen unterschiedlicher Herkunft werden verschiedene Methoden vorgestellt, mittels derer Reportergen-Experimente optimiert werden können. Um nur einige Parameter zu nennen, spielen - neben der Verwendung eines geeigneten Transfektions-Systems - Parameter wie Zelldichte, Menge an Transfektionsagens sowie das Verhältnis von Agens zu DNA und die Qualität der DNA eine wichtige Rolle.

Neben diesen grundlegenden Überlegungen werden verschiedene Strategien vorgestellt, mit deren Hilfe die Regulation eines Gens unter Verwendung von Reportergenassays analysiert werden kann. Als Beispiel sei hier der klassische Assay genannt, der dem Auffinden von cis-aktiven Elementen auf der DNA dient sowie dessen Optimierung durch die Verwendung von Referenzplasmiden. Daneben werden Strategien vorgestellt, mit deren Hilfe die Natur des mit den cis-aktiven Elementen wechselwirkenden Faktors hinterfragt werden kann, wie beispielsweise die gezielte Inaktivierung oder die Koexpression eines Faktors mittels eines Expressionsplasmides.

Andreas Jung, Pathologisches Institut, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg: "Usage of luciferase reporter constructs for studying target genes of b-catenin target genes during colorectal carcinogenesis"

Early during colorectal carcinogenesis the tumor suppressor gene APC (adenomatous polyposis coli) is mutated in up to 80 % of all sporadic occuring tumors. Mutations lead to loss of function of APC and as a consequence the oncogene b-catenin cannot be degraded any more because APC –in cooperation with other proteins- earmarks b-catenin for degradation. b-catenin binds to LEF/TCF (lymphoid enhancer factor/ T-cell factor) transcription factors which are members of the DNA binding HMG (high mobility group) family. These factors recognize specifically the sequence WWCAAAG. To work as a transcription factor, b-catenin must be located inside the nucleus of the cells and thus expression of b-catenin target genes is expected in such kind of cells. Tumor cells with nuclear b-catenin are especially found at the invasion front -that is the tumor-host interface- of colorectal tumors. One of the genes that are overexpressed in these cells is the cell cycle inhibitor p16^INK4a which inhibits transition of cells from the G₁- into S phase thus arresting the cell cycle. To show that p16^INK4a is a target gene of b-catenin functional experiments employing firefly luciferase reporter constructs were performed.

My talk will focus on design and performance of luciferase experiments, how to design experiments investigating the functional role of responsive elements. Moreover, technical problems and pitfalls which can occur during luciferase experiments are illuminated.

Claudia Dössereck, Berthold Detection Systems GmbH, Pforzheim: „Messung der Bio- und Chemilumineszenz: Allgemeine Grundlagen und spezielle Lösungen für Genexpressions-Studien“

Die Lumineszenz hat sich in den letzten Jahren zu einer leistungsfähigen Analysentechnik im weiten Feld der Life Sciences entwickelt. Die wachsende Zahl der Anwendungen und die Verfügbarkeit kommerzieller Kits definiert weitgehend die technischen Anforderungen an die in der Forschung oder der Routine-Analyse eingesetzten Luminometer.

Die Lumineszenz zeichnet sich durch eine hohe Empfindlichkeit, ein niedriges Hintergrundsignal in den untersuchten Materialien sowie einen großen Linearitätsbereich aus. Während bei der Chemilumineszenz Licht als Folge einer chemische Reaktion emittiert wird, ist bei der Biolumineszenz ein Enzym für die Anregung der lumineszierenden Substanz verantwortlich. Als Detektor kommt ein Photomultiplier zum Einsatz, der geringste Mengen Licht in ein elektrisches Signal umwandelt. Zwei Methoden zur Auswertung des Signals werden angewandt, das Stommessverfahren und das Photon-Counting-Verfahren.

Das von der Probe ausgesandte Licht unterscheidet man hinsichtlich seines zeitliche Verlaufes in stabile Glow-Type und kurze Flash-Type Reaktionen. Zur Auswertung des Signals werden die Lichtimpulse integriert oder aber die Kinetik des zeitlichen Verlaufs analysiert. Doch Luminometer leisten mehr! Sie erlauben es durch die Kombination mehrerer automatischer Reagenzienzugaben sowie Inkubations- und Meßschritte sehr komplexe Assays automatisch im Gerät durchzuführen.

Im wesentlichen bestimmt das Probenformat, Röhrchen bzw. Mikroplatte, das Design der Probenmesskammer eines Luminometers. Weitere technische Details sind die effektive Gestaltung des optischen Lichtwegs und die Unterbindung von Cross-Talk-Effekten bei der Auswertung stark leuchtender Proben in der Mikroplatte. Zur Erfassung kurzer Lichtsignale sowie für eine definierte Ablaufsteuerung bei der Probenzugabe kommen automatische Reagenzieninjektoren zum Einsatz. Neben der optimalen Durchmischung der Probe definieren Merkmale, wie flexibel einstellbare Injektionsvolumina, ein geringes Totvolumen und die Back-Pumping-Option die Anforderungen an ein Injektionssystem.

In der Präsentation werden spezifische Gerätekonfigurationen und Softwarelösungen für die Durchführung des Firefly Luciferase Assays und den Dual Luciferase Reporter Assay (DLR) vorgestellt.

Astrid Kehlen, Institut für Medizinische Immunologie, Martin-Luther-Universität Halle: "Untersuchungen zur Regulation von Aminopeptidase N mittels Dual-Luciferase-Reportergen-Assay"

Aminopeptidase N (APN)/CD13 (EC 3.4.11.2) ist eine Metallopeptidase mit einem Zink-abhängigen aktiven Zentrum. Sequenzvergleiche der geklonten cDNA zeigten, dass APN und CD13 identisch sind. Das Enzym kann ein breites Spektrum von Oligopeptiden spalten, wobei bevorzugt neutrale Aminosäuren von einem unsubstituierten N-Terminus freigesetzt werden. APN/CD13 ist ubiquitär verbreitet und galt lange als myeloischer Differenzierungsmarker.

Die Kontrolle der Regulation der Expression des APN/CD13-Gens erfolgt durch 2 Promotoren, von denen der entferntere „myeloischer“ Promotor genannt wird und der nahe dem Transkriptionsstart liegende „epithelialer“ Promotor heißt, entsprechend ihren Zelltyp-spezifischen Aktivitäten. Zwischen beiden Promotoren befindet sich ein Enhancer, der sowohl mit dem „myeloischen“ als auch dem „epithelialen“ Promoter interagieren kann.

Mittels Dual-Luciferase-Reportergen-Assay wurde die Promotoraktivität in lymphatischen (Jurkat) und myeloischen (K562, U937) Zellen sowie in Schilddrüsenkarzinomzellen untersucht. Dafür wurden Luciferease-Konstrukte mit dem myeloischen bzw. dem epithelialen APN/CD13-Promotor, Deletionskonstrukte des myeloischen Promotors, Konstrukte mit APN/CD13-Promotor und APN-Enhancer sowie mutierte APN/CD13-Promotor/Enhancer-Konstrukte verwendet. Nach Optimierung der Transfektionsbedingungen für den jeweiligen Zelltyp und Transfektion des Firefly-Luciferase-Reportergens und der Kotransfektion der internen Kontrolle Renilla-Luciferase wurden die transient transfizierten Zellen lysiert (Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System, Promega) und die Reportergenaktivität über Messung zuerst der Firefly-Luciferaseaktivität und nach Quentschen der Renilla-Luciferaseaktivität in einem Luminometer (Lumat LB 9507, Berthold) quantifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnten cis-aktive Elemente im myeloischen Promotor identifiziert und regulativ wichtige Bereiche im Enhancer charakterisiert werden. Des weiteren konnten wir die Zell-Zell-Kontakt induzierte APN-Promotoraktivität in Lymphozyten und die TGF-b-stimulierte Promotoraktivität in monozytären Zellen zeigen.

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