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Die Flexi® Vector Systeme bieten eine schnelle, einfache
und zuverlässige Möglichkeit, DNA-Sequenzen zwischen Vektoren zu
transferieren. Verschiedene Flexivektoren
stehen zur Auswahl, die je nach Bedarf die Expression von N-terminalen bzw. C-terminalen
Fusionsproteinen oder nativen (nicht-getaggten)
Proteinen
ermöglichen. Alle Flexivektoren enthalten das letale Barnasegen, das
durch das DNA-Fragment ersetzt wird und dadurch eine positive
Selektion des Inserts ermöglicht.
Die Flexivektorsysteme sind so konstruiert, dass keine unerwünschten
Aminosäurereste an das Protein angehängt werden. Die DNA wird direkt
in den Vektor kloniert, der für das gewünschte Expressionssystem
geeignet ist. Ein spezieller Eingangsvektor ist nicht erforderlich.
Die Flexivektoren enthalten die Schnittstellen der beiden seltenen
Restriktionsenzyme SgfI und PmeI. Proteincodierende Sequenzen
können mit Hilfe der SgfI- und
PmeI-Sites direkt in andere Flexivektoren überführt werden. Die
Orientierung des DNA-Fragments und der Leserahmen bleiben dabei
erhalten (Abb.1).Die SgfI-Schnittstelle
liegt upstream des Startcodons der proteincodierenden Region und
erlaubt die Expression der entsprechenden Proteine. Die PmeI-Schnittstelle
enthält das Stopcodon für die proteincodierende Sequenz. C-terminale
Flexivektoren (d.h. Flexivektoren, die C-terminal getaggte Proteine
exprimieren) können als Akzeptoren für DNA-Fragmente anderer
Flexivektoren genutzt werden. Sie besitzen selbst keine Pme
I-Schnittstelle, sondern eine andere blunt end-Site, nämlich EcoICR
I. Werden die Pme I und EcoICR I-Schnittstellen durch
Ligation verbunden, wird das Stopcodon in der neuen Anordnung nicht
wiederhergestellt. Die DNA wird bis zu der Sequenz weitergelesen,
die das C-terminale Fusionspeptid codiert. C-terminale Flexivektoren
sind daher nicht reversibel, d.h. die proteincodierende DNA kann nicht
wieder aus dem Vektor herausgeschnitten werden. Daher wird
empfohlen, das DNA-Fragment nicht direkt in den C-terminalen
Flexivektor, sondern zuvor in einen nativen oder N-terminalen
Flexivektor zu klonieren (Abb. 2).
| Merkmale |
Vorteile |
| Flexibilität |
Flexi®-Vektoren können in verschiedenen
Expressionssystemen eingesetzt werden (Bakterien,
Säugerzellen, in vitro). Ein Transfer zwischen verschiedenen
Systemen ist möglich. Je nach Bedarf können native Proteine
oder N-terminal bzw. C-terminal getaggte Proteine exprimiert
werden.
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| Zeitersparnis |
Ein Eingangsvektor ist nicht erforderlich. Der hocheffiziente Gentransfer ermöglicht es
dem Anwender, rekombinante Kolonien direkt zu verwenden.
Dadurch wird das zeitaufwendige Screening der rekombinanten
Kolonien überflüssig. |
| Produktivität |
Für Hochdurchsatzverfahren geeignet. |
Eine Übersicht über die einzeln erhältlichen Flexi-Vektoren
finden Sie hier. |
