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PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay, 1000
Reactions
PDE -Glo™ Phosphodiesterase Assay, 10.000
Reactions
Der PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay ist ein Biolumineszenztest
zur Bestimmung der zyklischen Nukleotid Phosphodiesterase-Aktivität
in aufgereinigten Quellen. Dieser speziell für
Hochdurchsatzverfahren konzipierte Test im Multiwell-Format liefert
bereits in weniger als einer Stunde die Aktivitäten sowohl cAMP- als
auch cGMP-abhängiger Phosphodiesterasen.
Aufgrund ihrer Eigenschaften als Kontrolleure von Second Messenger
Signal-Molekülen sind PDE’s bei einer Vielzahl von zellulären
Prozessen beteiligt und werden auch in Verbindung mit einigen
Krankheiten, wie z.B. Asthma, Errektionsstörungen oder
Autoimmun-Funktionsstörungen gebracht. Die Auswahl selektiver
Inhibitoren von PDE’s haben die Untersuchung der zyklischen
Nukleotid-Signalwirkung erleichtert und somit den Weg geebnet, um
die Rolle der PDE’s bei zellulären oder Gewebsveränderungen zu
erforschen. Der PDE-Glo™ Assay erlaubt es geeignete Inhibitoren aus
Bibliotheken zu identifizieren. Hierbei werden Veränderungen der
cNMP-Mengen über einen biochemischen Nachweis in Lumineszenz
umgewandelt, welche in direktem Zusammenhang mit der PDE-Aktivität
steht.
Funktionsprinzip des PDE-Glo™
Phosphodiesterase Assay:
Die Bindung von cNMP an das inaktive Proteinkinase A Holoenzym
bewirkt über eine Konformationsänderung die Freisetzung seiner
katalytischen Untereinheiten, welche dann unter ATP-Verbrauch die
Übertragung des terminalen Phosphates auf ein Substrat der
Proteinkinase A katalysieren. Mit dem Luziferase-basierten
Kinase-Glo® Reagenz kann nun die verbleibende Menge an ATP
luminometrisch bestimmt werden (vgl. Abb.1). Da PDE cAMP bzw. cGMP
zu AMP bzw. GMP hydrolysiert, nimmt die Menge an zyklischem
Nukleotid-Monophosphat (cAMP bzw. cGMP) ab. Daher wird weniger
Proteinkinase A aktiviert und weniger ATP verbraucht, welches nun
für die Luziferase-Reaktion zur Verfügung steht. Daraus resultiert
eine gesteigerte Lumineszenz. Diese ist somit direkt proportional zu
den verbleibenden ATP-Mengen, welche wiederum direkt proportional zu
den Mengen an PDE ist.
Abb: Schema des PDE-Glo™
Phosphodiesterase-Assay.
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