Multiplexing zur Detektion von Initiator- und Effektor-Caspasen
Ein Beispiel für das simultane Multiplexing stellt die Kombination von einem lumineszenten und einem fluoreszierenden Apoptose Assay dar.
Caspase-Glo
® Assays messen Caspaseaktivitäten unter Verwendung eines luminogenen Caspase Substrats und einer thermostabilen Ultra-Glow™ Luciferase.
Das Caspase-Glo
® Reagenz lysiert zunächst die Zellen. Aktivierte Caspasen spalten das enthaltene luminogene Caspase Substrat, Aminoluciferin wird bei dieser Reaktion freigesetzt und durch die Ultra-Glow™ Luciferase umgesetzt. Das dabei entstandene Lumineszenzsignal ist proportional zur vorhandenen Caspaseaktivität.
Derzeit stehen Caspase-Glo
® Assays für die Messung von Caspase-3/7, Caspase-8, und Caspase-9 Aktivitäten zur Verfügung.
Die Kombination der Caspase-Glo
® 8 oder 9 Assays mit dem Apo-ONE
® Homogeneous Caspase-3/7 Assay ermöglicht in einem Ansatz zusätzlich die Bestimmung von Effektor-Caspasen
(
Protokoll »). Der Apo-ONE
® Homogeneous Caspase-3/7 Assay verwendet ein profluoreszentes Caspase-3/7 Substrat, um aktive Caspasen-3 und -7 zu bestimmen. Die Menge des entstandenen Fluoreszenzsignals entspricht der Menge der in der Probe vorhandenen aktiven Caspase-3/7.
Anwendungsbeispiel:
Caspaseaktivitäten nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit rTrail:
Multiplexing von lumineszentem Caspase-8 mit fluoreszentem Caspase-3/7 Assay
Jurkat Zellen wurden ausgesät und alle 60 Minuten (über einen Zeitraum von 10h) mit 100ng/ml rTRAIL stimuliert. Kontrollzellen wurden mit 10% FCS in RPMI 1640 behandelt. Zur Bestimmung der Caspaseaktivitäten wurde anschließend pro Well 1 Volumen Caspase-Glo® 8 Reagenz zugegeben, in dem auch Apo-ONE® Caspase-3/7 Substrat gelöst war. Nach 1h Inkubation erfolgte die Lumineszenz-Messung der Caspase-8 Aktivität und die Fluoreszenz-Bestimmung (485Ex/530Em) von Caspase-3/7 Aktivität. Der Versuch zeigt die Wirkung von rTRAIL auf Initiator- (Caspase-8) und Effektor-Caspasen (Caspase-3/7). Die simultane Detektion beider Caspasen ermöglicht in einem Schritt, das Aktivierungsprofil zu analysieren und abzubilden.
Protokoll zur Bestimmung der Initiator- und Effektor-Caspaseaktivität unter Verwendung des Caspase-Glo® 8 oder 9 Assay (lumineszent) und Apo-ONE® Assay (Caspase-3/7 Aktivität, fluoreszent)
1. Zellen in 100µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiss) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
2. Caspase-Glo
® 8 oder 9 Assay Reagent vorbereiten. Apo-ONE
® Substrate auftauen und zu dem Caspase-Glo
® 8 oder 9 Reagent in einer 1:200 Verdünnung zugeben (50µl/10ml Caspase-Glo
® Reagent). Der Apo-ONE
® Buffer wird bei diesem Assay nicht verwendet. Zu jedem Well das gleiche Volumen (100µl) zugeben.
3. Für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Lumineszenz wie im Technischen
Protokoll Nr.
TB323 oder
TB333 beschrieben messen als Indikator der Caspase-8 oder Caspase-9 Aktivität.
4. Fluoreszenz (485Ex/527Em) des Apo-ONE
® Homogeneous Caspase-3/7
Assay wie im Technischen Protokoll Nr.
TB295 beschrieben messen als Indikator der Caspase-3 Aktivität.
