Diese erfolgt zeitversetzt in derselben Probe. Die Messung der Zellviabilität erfolgt mit Hilfe des CellTiter-Blue
Cell Viability Assays, der die Anzahl lebender Zellen in einer Zellkultur durch Messung des Reduktionspotentials bestimmt. Das CellTiter-Blue
Reagenz enthält Resazurin, welches durch metabolisch aktive Zellen in Resorufin umgewandelt wird. Das entstehende Fluoreszenzsignal ist direkt proportional zur Zahl der lebenden Zellen.
Jurkat Zellen wurden mit unterschiedlichen Staurosporin Konzentrationen behandelt. Das CellTiter-Blue
® Reagenz wurde unmittelbar nach Zugabe der Testsubstanz zu den Zellen pipettiert, 5 Stunden inkubiert und die Fluoreszenz bei 560Ex/590Em gemessen. Die Aktivität der Caspasen wurden durch Zugabe von 120 µl
Apo-One® Homogeneous Caspase 3/7 Assay Reagenz zu der gleichen Probe detektiert. Die Zellen wurden eine weitere Stunde inkubiert und anschließend die Fluoreszenz (485Ex/527Em) gemessen.
Protokoll zur Bestimmung der Zellviabilität und des Mechanismus des Zelltodes unter Verwendung von CellTiter-Blue® Assay (Viabilität, fluoreszent) und Apo-ONE® 3/7 Assay (fluoreszent)
1. Zellen in 100µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiss) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
2. Während der letzten 1-2 Stunden der Behandlung mit der Testsubstanz 20µl/Well CellTiter-Blue
® Reagent zugeben und bei 37oC inkubieren.
3. Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Technischen Protokoll Nr.
TB317 beschrieben messen, um die Zellviabilität zu bestimmen.
4. Das gleiche Volumen (120µl) Apo-ONE
® Homogeneous Caspase-3/7 Reagent zugeben und für 1-4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Fluoreszenz (485Ex/527Em) wie im Technischen Protokoll Nr.
TB295 beschrieben messen, um die Caspaseaktivität als Apoptosemarker zu bestimmen.
Protokoll zur Bestimmung der Zellviabilität und des Mechanismus des Zelltodes unter Verwendung von CellTiter-Blue® Assay (Viabilität, fluoreszent) und Caspase-Glo® 3/7 Assay (lumineszent)
1. Zellen in 100µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiss) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
2. Während der letzten 1-2 Stunden der Behandlung mit der Testsubstanz 20µl/Well CellTiter-Blue
® Reagent (1:4 verdünnt in Dulbecco’s PBS) zugeben und bei 37°C inkubieren.
3. Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Technischen Protokoll Nr.
TB317 beschrieben messen, um die Zellviabilität zu bestimmen.
4. Das gleiche Volumen (120µl) Caspase-Glo
® 3/7 Reagent zu jedem Well zugeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um ein Luziferasegleichgewicht zu erreichen.
5. Lumineszenz wie im Technischen Protokoll Nr.
TB323 beschrieben messen, um die Caspaseaktivität als Apoptosemarker zu bestimmen. Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass alle Wells nach der Inkubation mit Caspase-Glo
® Reagent eine gleichmäßige rosa Farbe haben. Wenn alle Wells die gleiche rosa Farbe haben während die Lumineszenz aufgezeichnet wird, wird das Licht in der gesamten Probe gleichmäßig gequencht, unabhängig von der CellTiter-Blue
® Ausgangsaktivität.
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