Bestimmung der Korrelation zwischen Zellviabilität und Zytoxizität
Die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) dient als Indikator für Zytotoxizität. Indem man den Mediumüberstand in ein neues Gefäß überführt und analysiert, verbleiben die Zellen für einen anderen Assay und einen anderen Parameter. Der CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay misst die Freisetzung von LDH aus Zellen in das umgebende Medium, deren Zellmembran ihre Integrität verloren hat. Da das CytoTox-ONE™ Reagenz lebende Zellen nicht schädigt, kann es direkt zur Zellkultur gegeben werden.
Die Bestimmung des Verhältnisses der lebenden und toten Zellen erfolgt durch Kombination des CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay mit dem CellTiter-Glo
® Luminescent Cell Viability Assay (
Protokoll »). Mit Hilfe des CellTiter-Glo
® Luminescent Cell Viability Assay wird die Zahl metabolisch aktiver Zellen in einer Zellkultur anhand des vorhandenen ATP-Gehaltes bestimmt. Der ATP-Gehalt ist direkt proportional zur Anzahl lebender Zellen.
Anwendungsbeispiel:
Zytotoxizität und Zellvitalität in Abhängigkeit der TNF-α-Konzentration
Zu L929 Zellen wurden unterschiedliche Konzentrationen TNF-α gegeben und über Nacht inkubiert. Die Bestimmung erfolgte in parallelen Ansätzen:
a) Zytotoxizitäts-Bestimmung: Das Zellmedium wurde auf eine neue Platte transferiert und nach Zugabe des Cytotox-ONE™ Reagenz die Fluoreszen (560Ex/590Em) bestimmt.
b) Zellvitalitäts-Bestimmung: Zu den verbliebenen Zellen wurde CellTiter-Glo® Reagenz (1:1) gegeben und nach 10 Minuten die Lumineszenz gemessen.
Der Versuch zeigt, dass Zellvitalität und Zytotoxizität miteinander korrelieren. Mit steigender TNF-α-Konzentration nimmt die Vitalität ab und gleichzeitig steigt die Zytotoxizität an.
Protokoll zur Bestimmung der Korrelation zwischen Zellviabilität und Zytoxizität unter Verwendung des CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay (LDH Freisetzung, fluoreszent) und CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (ATP Gehalt, lumineszent)
1. Zellen in 100µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiss) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
2. Überstand auf eine neue Platte transferieren und CytoTox-ONE™ Reagent zugeben.
3. Inkubieren und Fluoreszenz (560Ex / 590Em) wie im Technischen Protokoll Nr.
TB306 beschrieben messen.
4. CellTiter-Glo
® Reagent zu den Zellen in der ursprünglichen Platte zugeben und Lumineszenz wie im Technischen Protokoll Nr.
TB288 beschrieben messen.
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