Proteinexpression

Themen auf dieser Seite:
1. Expression funktioneller Proteine »
2. Optimierte Proteinexpression in E. coli »
3. Regulierte Expression in Säugerzellen »

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1. Expression funktioneller Proteine

TnT® In Vitro Transkriptions- /Translationssysteme
Wenn man die Funktion und die Struktur von Proteinen untersuchen möchte, ist es wichtig, die Proteine nativ zu exprimieren.
Der klassische Versuchsansatz hierbei ist die Expression von Proteinen in lebenden Zellen, wie z.B. in E.coli oder in Säugerzellkulturen. Promega bietet mit den TnT® Systemen eine einfache und schnelle alternative Methode, direkt funktionelle Proteine zu exprimieren − ohne den Umweg über eine Expression in Zellkultur.

Die TnT® In Vitro Expressionssysteme bestehen aus einem zellfreien Extrakt, gewonnen aus gängigen Organismen, wie z.B. Säuger, Pflanzen oder Insekten. Alle Komponenten für die gekoppelte Proteintranskription und −translation wie z.B. Ribosomen, t-RNAs, Aminosäuren, Nukleotide und Polymerasen sind im Lysat vorhanden und jede Art von kodierender Nukleinsäure ist als Ausgangsmaterial einsetzbar: RNA, Plasmid-DNA oder PCR Produkt. Wichtige Voraussetzung ist nur der für das System passende Promotor. Diese zellfreien Expressionssysteme bieten dem Wissenschaftler das notwendige Werkzeug, Proteine nativ zu exprimieren um ihre Wechselwirkungen mit anderen Molekülen zu analysieren.

Auswahl des geeigneten Systems:
TnT Selector »


Fragen zum System?
Unsere Technische Beratung hilft Ihnen weiter:
de_techserv@promega.com

Vergleich der Expression von 55 humanen Proteinen
Das TnT® High Yield System ermöglicht die Expression von funktionellen, eukaryotischen Proteinen.
In E. coli konnten nur 3 von 55 humanen Proteinen erfolgreich exprimiert werden. Dahingegen konnten all diese Proteine
in vitro mittels TnT® High Yield hergestellt werden.

	Template				Protein- menge	Ausgangs-material	Vektor-empfehlungen
Promega zellfreie Expressions-Systeme	RNA	DNA	RBS nötig	Kozak nötig
S30 T7 High Yield Protein Expression System Produktinfos »	Ja	Ja	Ja	-	bis zu 500 µg/ml	Plasmid-DNA mit T7 Promotor	Plasmid-DNA mit T7 Promotor
TnT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System Produktinfos »	Ja	Ja	-	Ja	bis zu 75 µg/ml	pF25A/K ICE T7 Flexi® Vector	pF25A/K ICE T7 Flexi® Vector
TnT® SP6 High Yield Protein Expression System Produktinfos »	Ja	Ja	-	Ja	bis zu 100 µg/ml	Plasmid-DNA mit SP6 Promotor	pF3 WG (BYDV) Flexi® Vectors
TnT® Coupled Transcription / Translation System Produktinfos »	Ja	Ja	-	Ja	bis zu 6 µg/ml	Plasmid-DNA mit T7 oder SP6 Promotor, PCR-Produkte mit T7 oder SP6 Promotor	pTNT vector, pcmv TNT vector

Vorteile:
Schnell	Expression funktioneller Proteine innerhalb von 90 Minuten
Flexibel	Proteine können für verschiedene Applikationen verwendet werden
Funktionelle Proteine	Posttranskriptionelle Modifikationen werden eingefügt
Einfach	Zusätzliche Aufreinigung ist nicht notwendig

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2. Optimierte Proteinexpression in E. coli

Ein Bakterienstamm für Klonierung und Expression − Single Step (KRX) Competent Cells
KRX Zellen sind sowohl für die Klonierung als auch für die Proteinexpression hervorragend geeignet. Neben den Eigenschaften eines guten Klonierungsstamms − wie z.B. ein teilweise defektes Restriktionssystem, Rekombinationsdefizienz und die Möglichkeit der blau/weiss Selektion − sind sie auch für die Expression sehr gut einsetzbar.
Bei diesem E. coli Stamm wird die T7 RNA Polymerase durch einen Rhamnose Promotor kontrolliert, der vollständig durch Glukose abschaltbar ist (Katabolitrepression). Die Rhamnose kann aufgrund einer Gendeletion nicht metabolisiert werden − so wird das Wunschprotein konstant exprimiert.
Diese Eigenschaft bietet zudem den Vorteil auch toxische Proteine exprimieren zu können.

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Technisches Protokoll »

Expression von Firefly Luciferase
Expression von Firefly Luciferase vor und nach der Induktion. Bakterien wurden mit einem Vektor transformiert, der das Firefly Luciferase Gen kodiert. Starterkulturen wurden übernacht in LB Medium mit 0,2% Glukose und 30 µg/ml Kanamycin bei 37°Ã‚°C bis zu einer OD600 von 0,8-1,0 kultiviert. Danach wurde die Temperatur auf 25°Ã‚°C gesenkt und nach Erreichen einer OD600 von 1,0-1,5 mit 0,1% Rhamnose oder 1mM IPTG über Nacht unter Schütteln induziert. Luciferase Aktivität wurde mit Bright-Glo™ Luciferase Assay Reagenz ermittelt. (A) Dargestellt sind die relativen Lumineszenzen der Proben vor und nach Induktion dividiert durch die OD600 Werte. (B) Die relativen Lumineszenzen nach der Induktion wurden durch die relativen Lumineszenzen vor der Induktion dividiert, um die Induktionsrate zu berechnen.

Vorteile:
Schnell	Nur ein Bakterienstamm für Klonierung und Proteinexpression
Robust	Expression toxischer Proteine möglich
Konstante Expression	Die Expression der T7 RNA Polymerase bleibt bei gleichem Rhamnose-Gehalt konstant hoch

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3. Regulierte Expression in Säugerzellen

Das Regulated Mammalian Expression System (RMES)
Das RMES ermöglicht eine sehr genau Regulierung der Proteinexpression in Säugerzellen. Dies wird durch die Transfektion zweier Plasmide ermöglicht. Das eine trägt das zu exprimierende Gen, dem ein Operator (12xλOp) vorgeschaltet ist. Das andere kodiert für einen chimeren Transaktivator, der aus zwei Gyrase B Untereinheiten besteht; auch diesem Gen ist der gleiche Operator vorgeschaltet.
Durch einen minimalen SV40 Promotor wird eine geringe Basalexpression des Transaktivators erreicht, der erst durch die Zugabe von Coumermycin in seine aktive Form homodimerisiert. Er bindet nun an den Operator, der dem zu exprimierenden Gen und dem Transaktivator vorgeschaltet ist und leitet eine positive Autoregulation des Transaktivators ein. Novobiocin blockiert die Dimerisierung des Transaktivators.
Damit wird die Expression des Zielproteins verhindert, da der Operator (12xλOp) nicht mehr gebunden werden kann. Coumermycin und Novobiocin wirken stöchiometrisch, daher kann durch unterschiedliche Mengen der beiden Substanzen die Konzentration des Zielproteins beeinflusst werden.

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Hemmung der Coumermycin-induzierten Proteinexpression
CHO Zellen, die eine regulierte Renilla Luciferase stabil exprimieren, wurden in 96-Well Platten ausplattiert. Im nächsten Schritt wurden EnduRen™ Live Cell Substrate und 5 nM Coumermycin zu den Zellen pipettiert und Renilla Luciferase Aktivität nach 14 h ermittelt. Dieser Wert entspricht dem Zeitpunkt t=0. Danach wurde 10 µM Novobiocin zu einem Teil der Wells gegeben und Renilla Luciferase Aktivität gemessen. Jeder abgebildete Datenpunkt entspricht dem Durchschnitt von 12 Messpunkten.

Vorteile:
Regulierbar	Die Expression kann an- und ausgeschaltet werden
Viel Protein	Hohe Expression des Zielproteins durch positive Autoregulation

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