Proteincharakterisierung
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Trypsin »
4. Endoproteinase
Lys-C »
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1. Trypsin-Gold
Die Qualität der Proteasen ist ein wichtiger
Baustein für eine erfolgreiche Probenvorbereitung.
Trypsin von geringer Qualität unterliegt häufig
einer Autoprotolyse, die zur Bildung von
Pseudotrypsin mit Chymotrypsin-ähnlicher Aktivität
führt. Eine solche Aktivität in einem Probenansatz
würde zusätzliche Peptidfragmente generieren, die
mit der späteren Datenbankanalyse interferieren
können. Zusammen mit
ProteaseMax™ bilden die Trypsinpräparationen ein
unschlagbares Team bei der Proteinprobenvorbereitung
für die MS Analyse.
|
Vorteile:
|
| Anwenderfreundlich |
Kompatibel mit ProteaseMax™ Surfactant,
Trypsin Enhancer |
| Stabil |
Resistent gegenüber milden denaturierenden
Bedingungen |
| Zuverlässig |
Reduktive Methylierung verhindert den
autolytischen Verdau |
| Sicher |
Behandlung mit TPVK inaktiviert Chymotrypsin |
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2. ProteaseMax™
Der ProteaseMax™ Surfactant, Trypsin Enhancer ist
ein neues Reagenz, das den Trypsinverdau
insbesondere bei Membranproteinen verbessert und die
Peptidausbeute bei Gelextraktionen erhöht.
ProteaseMax™ ist so konzipiert, dass es über den
Verlauf eines Trypsinverdaus degradiert und daher
die MS Analyse nicht stört.
Abb.: Ein zytoplasmatischer Proteinextrakt aus dem
Herzen einer Maus wurde auf einem 4-20% SDS-PAGE Gel
elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde
die Proteinbande mit der Masse von 47 kDa aus dem
Gel ausgeschnitten, tryptisch verdaut und
massenspektroskopisch untersucht.
A. Standardverdauprotokoll ohne ProteaseMax™ über
Nacht bei 37°C
B. Mit ProteaseMax™ über 3 Stunden bei 37°C
|
Vorteile:
|
| Schnell |
Verkürzt den Trypsinverdau auf 1 Stunde,
verbesserte Peptidausbeute |
| Zuverlässig |
Bessere Sequenzabdeckung und höhere MASCOT
scores |
| Anwenderfreundlich |
Keine nachträgliche Inaktivierung notwendig,
beeinflusst nicht die MS Analyse |
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3. Immobilisiertes Trypsin
Immobilisiertes Trypsin erlaubt den schnellen und
einfachen Verdau von Proteinen in Lösung. Die
Elution der verdauten Peptide erfolgt mittels
Zentrifugation, wobei das Trypsin auf der Säule
verbleibt.
|
Vorteile:
|
| Schnell |
Proteolytischer Verdau innerhalb von 30
Minuten |
| Skalierbar |
Erlaubt den Verdau unterschiedlichster
Proteinmengen |
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Video-Protokoll (26MB, mov) »
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4. Endoproteinase Lys-C
Lys-C hydrolisiert spezifisch am C-terminalen Ende
von Lysin.
|
Vorteile:
|
| Robust |
Funktionalität von Lys-C im pH-Bereich von
7,0 - 9,0 |
| Flexibel |
Verdau in Lösung und in-Gel Verdau möglich |
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