Protein-Protein-Interaktionen
Pull-down Assays werden häufig verwendet, um die
Wechselwirkung zwischen einem bekannten Protein
(Bait-Protein) und einem Interaktionspartner
(Prey-Protein) zu untersuchen. Dabei wird das
Bait-Protein meist als Fusionsprotein mit einem Tag
exprimiert.
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HaloTag®-basierte Pull-down Assays in Zellen
In vielen Fällen eines Pull-down Assays stören
unspezifische Bindungen die Identifizierung des
Prey-Proteins. Die kovalente Bindung von HaloTag®
Fusionsproteinen an HaloLink™Resin ermöglicht ein
stringentes Waschen der Bait-/Prey-Komplexe. Dadurch
werden unspezifisch bindende Proteine besser
entfernt. In diesem Fall werden Zellen mit einem zu
untersuchenden HaloTag® Fusionsprotein (Bait)
transfiziert, das mit potentiellen endogenen
Proteinen interagiert. Zellen werden lysiert und die
Komplexe mit HaloLink™ Resin immobilisiert. Nach
Waschen werden die Prey-Proteine per SDS-PAGE
identifiziert.
Schematische Darstellung des HaloTag®
Pull-Down Assays in Zellen
Zunächst wird die kodierende Sequenz des Baitâ„¢
Proteins in einen HaloTag® Expressionsvektor
kloniert und anschließend in eine geeignete
Zelllinie transfiziert. Das HaloTag®-,baitâ„¢
Fusionsprotein interagiert daraufhin mit dem
endogenen Preyâ„¢ Protein. Nach der Zelllyse wird
der gesamte Komplex mit HaloLink-Resin immobilisiert
und gewaschen, um unspezifisch bindende Proteine zu
entfernen. Zuletzt wird das Preyâ„¢ Protein eluiert
und mittels SDS-PAGE Gel-Elektrophorese/Western
Blotting oder massenspektroskopisch identifiziert.
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Protein Interaction Guide (PDF/1,8 MB) »
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Mehr Prey Ausbeute mit HaloLink™ Resin.
GST-c-Fos und c-Jun-HaloTag® Fusionsproteine wurden
in einem zellfreien TnT® System mit oder ohne
35[S]-Methionin exprimiert. Nicht-radioaktiv
markierte Fusionsproteine dienen als bait,
radioaktiv-markierte als prey. In zwei getrennten
Reaktionen wurden jeweils radioaktiv- oder
nicht-radioaktiv markiertes GST-c-Fos und
c-Jun-HaloTag® gemischt. Nach der Inkubation wurden
die Proteinkomplexe mit HaloLink™ Resin (links) oder
Glutathion Beads (rechts) präzipitiert. Dargestellt
sind HaloLink™ Resin oder
Glutathion Beads mit und
ohne Proteinkomplex.
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Weiterführender Artikel zum Thema Pull-Down (PDF,
englisch) »
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