Protein-Protein-Interaktionen

Pull-down Assays werden häufig verwendet, um die Wechselwirkung zwischen einem bekannten Protein (Bait-Protein) und einem Interaktionspartner (Prey-Protein) zu untersuchen. Dabei wird das Bait-Protein meist als Fusionsprotein mit einem Tag exprimiert.

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HaloTag®-basierte Pull-down Assays in Zellen

In vielen Fällen eines Pull-down Assays stören unspezifische Bindungen die Identifizierung des Prey-Proteins. Die kovalente Bindung von HaloTag® Fusionsproteinen an HaloLink™Resin ermöglicht ein stringentes Waschen der Bait-/Prey-Komplexe. Dadurch werden unspezifisch bindende Proteine besser entfernt. In diesem Fall werden Zellen mit einem zu untersuchenden HaloTag® Fusionsprotein (Bait) transfiziert, das mit potentiellen endogenen Proteinen interagiert. Zellen werden lysiert und die Komplexe mit HaloLink™ Resin immobilisiert. Nach Waschen werden die Prey-Proteine per SDS-PAGE identifiziert.

Schematische Darstellung des HaloTag® Pull-Down Assays in Zellen
Zunächst wird die kodierende Sequenz des Baitâ„¢ Proteins in einen HaloTag® Expressionsvektor kloniert und anschließend in eine geeignete Zelllinie transfiziert. Das HaloTag®-,baitâ„¢ Fusionsprotein interagiert daraufhin mit dem endogenen Preyâ„¢ Protein. Nach der Zelllyse wird der gesamte Komplex mit HaloLink-Resin immobilisiert und gewaschen, um unspezifisch bindende Proteine zu entfernen. Zuletzt wird das Preyâ„¢ Protein eluiert und mittels SDS-PAGE Gel-Elektrophorese/Western Blotting oder massenspektroskopisch identifiziert.

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Mehr Prey Ausbeute mit HaloLink™ Resin.
GST-c-Fos und c-Jun-HaloTag® Fusionsproteine wurden in einem zellfreien TnT® System mit oder ohne 35[S]-Methionin exprimiert. Nicht-radioaktiv markierte Fusionsproteine dienen als bait, radioaktiv-markierte als prey. In zwei getrennten Reaktionen wurden jeweils radioaktiv- oder nicht-radioaktiv markiertes GST-c-Fos und c-Jun-HaloTag® gemischt. Nach der Inkubation wurden die Proteinkomplexe mit HaloLink™ Resin (links) oder Glutathion Beads (rechts) präzipitiert. Dargestellt sind HaloLink™ Resin oder
Glutathion Beads mit und
ohne Proteinkomplex.

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Weiterführender Artikel zum Thema Pull-Down (PDF, englisch) »
HaloTag® Vektorauswahl-Tool »

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