CheckMate™/Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System

Das CheckMate™/Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System wurde zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen speziell in Säugerzellen entwickelt. Im Unterschied zu den herkömmlichen CheckMate-Systemen ist es mit den Flexi-Vektoren kompatibel.

Das CheckMate™/Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System wurde nach dem Vorbild des Hefe-Two-Hybrid-Systems konzipiert. Säugerzellen werden mit drei Plasmiden co-transfiziert:

• Der pFN10A (pACT) Flexi® Vector enthält eine Herpes simplex Virus VP16 Transkriptions-Aktivierungsdomäne upstream der Klonierungsstelle.
• pFN11A (pBIND) Flexi® Vector besitzt die Hefe GAL4 DNA-Bindedomäne upstream der Klonierungsstelle. Der Vektor exprimiert die Renilla reniformis Luciferase unter der Kontrolle des SV40-Promotors. Die Renilla-Luciferaseaktivität dient zur Transfektionskontrolle.
• Der dritte Vektor, pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/hygro] besitzt fünf GAL4-Bindestellen upstream einer Minimal-TATA-Box, die wiederum upstream des Firefly-Luciferase-Gens liegt.

Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wird die DNA-Sequenz des einen Proteins (X) in den pBIND-Vektor kloniert, so dass ein Fusionsprotein des Proteins X mit der GAL4-DNA-Bindedomäne entsteht. Das zweite zu untersuchende Protein (Y) wird in den pACT-Vektor kloniert. Das exprimierte Fusionsprotein enthält Protein Y an die Transkriptions-Aktivierungsdomäne gekoppelt. Im Falle einer Interaktion der beiden Proteine X und Y findet eine DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung des Firefly-Luciferasegens statt. Die Aktivität der exprimierten Firefly-Luciferase ist ein Maß für die Protein-Protein-Wechselwirkung.

Die Positivkontroll-Vektoren CheckMate™ Positive Control Vectors codieren für zwei Proteine, von denen bekannt ist, dass sie in vivo interagieren. Als Negativkontrolle (CheckMate™ Negative Control Vectors) werden die Plasmide pACT und pBIND verwendet.