Imaging von lebenden Zellen
Um Proteine in lebenden Zellen sichtbar zu machen,
werden diese gewöhnlich mit einem Fluoreszenzprotein
wie z.B. GFP fusioniert und exprimiert. Bei der
Bildung des Chromophors werden bei den
Fluoreszenzproteinen vom GFP-Typ reaktive
Sauerstoff-Spezies freigesetzt, die für Zellen
toxisch sein können. Durch überexpression verstärkt
sich dieser Effekt zusätzlich und kann sich
nachteilig auf die Zellvitalität auswirken. Weder
HaloTag® Fusionsproteine noch die HaloTag®
Fluoreszenzliganden haben Einfluss auf die
Zellphysiologie oder sind für die Zellen toxisch. Da
HaloTag® selbst keine Eigenfluoreszenz aufweist, ist
der Zeitpunkt der Detektion frei wählbar.
Im Experiment werden die Fluoreszenz-Liganden direkt
ins Kulturmedium gegeben und werden nach einer
kurzen Inkubation mikroskopisch analysiert. Darüber
hinaus ist die HaloTag® Technologie mit
herkömmlicher Immunozytochemie kompatibel.
Wir empfehlen:
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Live Cell Imaging:
Nukleäre Translokation von HaloTag-p65
HeLa Zellen wurden mit dem HaloTag® Protein
transfiziert, das mit der p65 Untereinheit des
Transkriptionsfaktors nuclear factor κB
fusioniert ist. Zellen wurden mit dem HaloTag®
TMR Liganden (5 µM, 15 min) inkubiert, mit
MEM/FBS gewaschen und mit TNF-α (20 ng/ml)
stimuliert. Bilder wurden alle 5 min mit dem
Olympus FV500 Konfokalmikroskop über einen
Zeitraum von 2 h aufgenommen.
Färbung von lebenden Zellen mit HaloTag® TMR
Ligand und anschließende Fixierung.
HEK 293 Zellen wurden mit einem HaloTag® Protein
stabil exprimiert, das mit einer nukleären
Lokalisationssequenz fusioniert ist. Diese und
Kontrollzellen wurden mit HaloTag® TMR Ligand
inkubiert. Nach Waschen wurden die Bilder mit einem
Konfokalmikroskop oder einem Epifluoreszenzmikroskop
mit den entsprechenden Filtersets aufgenommen.
Abgebildet ist die Fluoreszenz (obere Reihe) oder
DIC mit Fluoreszenz überlagert (untere Reihe). Man
erkennt, dass die Färbung der stabil transfizierten
Zellen lediglich auf den Zellkern beschränkt ist,
während die Zellkerne der Kontrollzellen ungefärbt
bleiben. Die anschließende Fixierung hat keine
signifikanten Einflüsse auf die Fluoreszenzsignale
der Proben.
Live Cell Imaging eines Zellmembranproteins.
HEK 293 Zellen wurden mit einem HaloTag®-ß1-Integrin
Fusionsplasmid stabil transfiziert. Diese wurden mit
dem HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand inkubiert und
die Lokalisation des Fusionsproteins per
Konfokalmikroskopie mit dem entsprechenden Filterset
detektiert. (A) Fluoreszenzaufnahme, (B) DIC mit
Fluoreszenz überlagert. Die Abbildungen zeigen
deutlich, dass das Fusionsprotein ausschließlich auf
der Zellmembran lokalisiert ist.
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