Recombinant RNasin^® RNase Inhibitor und RNasin^® Plus RNase Inhibitor

Seit über 25 Jahren wird RNasin^® weltweit als Standardreagenz in molekularbiologischen Laboratorien eingesetzt. RNasin^® eignet sich für zahlreiche Anwendungen, bei denen der Schutz von RNA vor allgegenwärtigen RNasen von Bedeutung ist. Das 50 kDa große Protein inhibiert RNase A, B und C sowie humane placentale RNase in nichtkompetitiver Weise durch Bindung im Verhältnis 1:1. Andere RNasen und modifizierende Enzyme wie Reverse Transkriptasen werden nicht inhibiert. Diese Eigenschaften von RNasin^® führen zu erhöhter Ausbeute bei RNA-Extraktionen und besserer Performance von RT-PCR, cDNA-Synthese, Microarrays und in vitro Transkription/Translation. Recombinant RNasin^® ist ein rekombinantes Protein aus E. coli.

Seit einigen Jahren ist RNasin^® Plus bei Promega erhältlich. Unsere Wissenschaftler haben es so optimiert, dass es stabiler gegen Oxidation und Hitze ist als natives RNasin^®, was ihm eine höhere Stabilität und Lebensdauer verleiht. Dadurch ist es besonders geeignet als Additiv bei der Langzeitlagerung von RNA-Proben und zum Einsatz in RT-PCRs mit höheren Denaturierungs-Temperaturen.

Häufig gestellte Fragen zu RNasin® Plus RNase Inhibitor und RNasin® RNase Inhibitor

Was ist RNasin® Ribonuclease Inhibitor und wie wirkt er?

RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Kat.Nr. N2111, N2115), entwickelt von Promega, inhibiert ein breites Spektrum von RNasen. Er verhindert die Degradation von RNA in einer Vielzahl von Anwendungen, wo Kontaminationen mit RNasen vorkommen können.
RNasin® Ribonuclease Inhibitor ist ein 50kDa Protein, dessen inhibitorischer Effekt durch starke nichtkovalente Bindung (k>10¹⁴) an RNasen im Verhältnis 1:1 zustande kommt.

Was ist der Unterschied zwischen RNasin® Ribonuclease Inhibitor und Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor?

Die beiden Produkte unterscheiden sich nicht in ihrer Anwendung, da der Unterschied nur im Ursprung des Proteins liegt. RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Kat.Nr. N2111, N2115) stammt ursprünglich aus humaner Placenta und wird immer noch aus dieser natürlichen Quelle isoliert. Der Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Kat.Nr. N2511, N2515) wurde von Promega entwickelt, um eine noch bessere Reinheit und gleichbleibende Qualität zu erhalten. Da das Protein aus E. coli gewonnen wird, enthält es keine Spuren von humaner DNA, was bei bestimmten Applikationen problematisch sein könnte.

Was ist RNasin® Plus RNase Inhibitor? Was sind die Eigenschaften dieses Ribonuclease Inhibitors?

RNasin® Plus RNase Inhibitor ist ein rekombinanter Säugetier-RNase Inhibitor, der als lösliches Protein in E. coli exprimiert wird. Aufgrund natürlicher Aminosäurediversität zeigt RNasin® Plus RNase Inhibitor (Kat.Nr. N2611, N2615) im Vergleich zum humanen RNasin® eine erhöhte Stabilität gegenüber Oxidation. Bei der Entwicklung von RNasin® Plus RNase Inhibitor konnten unsere Wissenschaftler die andauernde Inhibierung von RNasen nachweisen, sogar oberhalb der normalen Denaturierungstemperatur des RNasin® Plus Moleküls. Eine Mischung von RNasin® Plus und einer reinen RNase, wie RNase A, kann für 15 min auf 70°C erhitzt werden, und die RNase A Aktivität kehrt nach dem Abkühlen auf Temperaturen wie in einer RT-Reaktion nicht zurück. Es wurde gezeigt, dass RNasin® Plus auch in einer komplexen Mischung aus RNasen wie in einem Extrakt aus Rattenleber (Sigma Kat.Nr. L1380) auf diese Weise wirkt. Rattenleber enthält mindestens vier Ribonukleasen (Zhao, W. et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1384, 55-65). Bei der Inkubation von 100ng or 10ng Templat-RNA mit einer Mischung aus Rattenleber-RNasen und RNasin® Plus RNase Inhibitor, die zuvor 15 min auf 70°C erhitzt wurden, für 1 h bei 37°C konnte keine RNase-Aktivität detektiert werden.

Wodurch ist RNasin® Plus RNase Inhibitor stabiler gegen Oxidation als natives oder rekombinantes RNasin®?

Zwei Cysteinreste im humanen Protein wurden als besonders anfällig für Oxidation identifiziert. Sie reagieren zu einer Disulfidbrücke, welche das aktive Zentrum des Inhibitors blockiert (Kim, B.M. et al. (1999) Protein Sci. 8, 430-4.). RNasin® Plus RNase Inhibitor kann diese Disulfidbrücke durch natürliche Aminosäurediversität nicht ausbilden.

Welche Nukleasen und Polymerasen werden von RNasin® Ribonuclease Inhibitor inhibiert, welche nicht?

Zusammenstellung der Effekte von RNasin® Ribonuclease Inhibitor auf ausgewählte Nukleasen und Polymerasen:
Inhibiert:
RNase A, RNase B, RNase C, Human placental RNase, Angiogenin
Inhibiert nicht:
RNase T1, S1 Nuclease, RNase aus Aspergillus, RNase H, RNase ONE™ Ribonuclease, Taq DNA Polymerase, AMV or M-MLV Reverse Transcriptase, SP6, T7, oder T3 RNA Polymerase

Welche Anwendungen sind mit RNasin® Plus RNase Inhibitor kompatibel?

RNasin® Plus RNase Inhibitor wurde getestet in RT-PCR und ist kompatibel mit den Reversen Transkriptasen AMV, M-MLV und ImProm-II™ und den DNA Polymerasen Taq und Tfl. RNasin® Plus RNase Inhibitor eignet sich auch zum Einsatz in der quantitativen (real-time) RT-PCR (getestet mit TaqMan® Assay). Der neue Inhibitor ist außerdem kompatibel mit dem Riboprobe® System zur in vitro Transkription mit T3, T7 oder SP6 RNA Polymerase. RNasin® Plus RNase Inhibitor kann auch im Wheat Germ Extract und Rabbit Reticulocyte Lysate für in vitro Translation aus einem RNA-Templat sowie im TNT® Wheat Germ und TNT® Reticulocyte Lysate System zur gekoppelten in vitro Transkription/Translation verwendet werden.

Ist RNasin® Plus RNase Inhibitor effektiver als natives oder rekombinantes RNasin?

RNasin® Plus RNase Inhibitor (Kat.Nr. N2611, N2615) ist von Natur aus resistenter gegen Oxidation, was zu einer gesteigerten Effizienz führt, z.B. die dauerhafte Inhibierung von RNasen bei höheren Temperaturen. Als in E. coli exprimiertes Protein wird RNasin® Plus durch Kombination einfacher chromatographischer Methoden aufgereinigt. Eine spezielle Affinitätschromatographie ist nicht notwendig. Dadurch erhält man Protein mit einer Reinheit von über 90% ohne Verunreinigungen durch E. coli RNasen. Die Wirkungsweise von RNasin® Plus entspricht jedoch dem von nativem oder rekombinantem RNasin®. Dieser Mechanismus ist die Inhibierung durch nichtkovalente Bindung im Verhältnis 1:1 von RNasin® an RNasen.

Unter welchen Bedingungen ist der RNasin® Ribonuclease Inhibitor aktiv? Welche Reaktionsbedingungen sollten vermieden werden?

RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Kat.Nr. N2611, N2615) ist aktiv in einem weiten Bereich von Reaktionsbedingungen von pH 5-8 (höchste Aktivität bei pH 7-8). Während DTT den RNasin® Ribonuclease Inhibitor bei Langzeitlagerung stabilisiert, ist es nicht nötig für die Aktivität von RNasin®.
Im allgemeinen sollten alle Reaktionsbedingungen vermieden werden, die zur Dissoziierung des RNasin® Ribonuclease Inhibitor-RNase-Komplexes führen, sowie Bedingungen, die zur Denaturierung von RNasin® Ribonuclease Inhibitor, aber nicht von RNasen führen. Dies sind u.a.: Temperaturen >50°C, Gegenwart von Harnstoff, SDS oder anderen denaturierenden Substanzen.

Wie kann ich die Eigenschaften von RNasin® Plus RNase Inhibitor nutzen, um meine RNA-Template besser zu schützen?

Viele Protokolle einschließlich dem des ImProm-II™ Reverse Transcription System empfehlen einen initialen Hitzeschritt zur Denaturierung des RNA-Templats in der Gegenwart von RT-Primern für 5-10 min bei 70°C, gefolgt von einer schnellen Abkühlung auf Eis. Dieser Schritt bricht Sekundärstrukturen im RNA-Templat auf, um eine höhere Sensitivität bei der RT-PCR zu erreichen.
Bei der Entwicklung des RNasin® Plus RNase Inhibitor, haben die Wissenschaftler von Promega eine fortwährende Inhibierung der RNasen gefunden, sogar oberhalb der normalen Denaturierungstemperatur von RNasin® Plus. Eine Mischung aus RNasin® Plus und reiner RNase, z.B. RNase A, kann für 15 Min auf mind. 70°C erhitzt werden, ohne dass die Aktivität der RNasen bei den niedrigeren Temperaturen der RT-Reaktion wieder auftritt. Aufgrund dieser Eigenschaft von RNasin® Plus RNase Inhibitor, kann man ihn schon in diesem Schritt zugeben, um das RNA-Templat bei der Denaturierung zu schützen. Alle RNasen, die zu diesem Zeitpunkt vorhanden sind, werden inhibiert. Trotzdem sollte man danach noch einmal RNase-Inhibitor zugeben, um vor neu eingebrachten RNasen, z.B. aus Pipetten oder Reaktionskomponenten zu schützen.

Welche Vorteile bietet RNasin® Plus RNase Inhibitor in RT-Reaktionen bei höheren Temperaturen?

Die Fähigkeit von RNasin® Plus RNase Inhibitor (Kat.Nr. N2611, N2615), RNasen sogar bei Temperaturen zu binden, bei denen es alleine denaturieren würde, ist eine sehr nützliche Eigenschaft. Diese gewährleistet den Schutz vor RNasen bei der Erststrangsynthese bei hohen Temperaturen (50°C) aus Templaten mit anspruchsvoller Sekundärstruktur.