Eigenschaften
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praktisch
alle Reagenzien in einem Kit
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sensitiv
transkribiert schwierige Templates
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effizient
schreibt lange mRNA vollständig um
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robust
optimierter Puffer in Kombination mit Hot Start Polymerase sorgt für reproduzierbare Ergebnisse
Das GoTaq® 2-Step RT-qPCR System vereint die Vorteile vom GoScript™ Reverse Transciptase System und dem GoTaq®qPCR Master Mix. Quantifizierung von RNA ist mit dem System einfach, effizient und sensitiv.
Das System kann mit allen bekannten Thermocyclern eingesetzt werden. Zur Detektion werden dieselben Filtersets verwendet wie bei SYBR®* Green und ROX™**.
Anwendungen:
- Sequenzdetektion und −quantifizierung (Nachweis von Pathogenen)
- Genexpressionsanalysen (Validierung von Microarrays)
- Detektion von Sequenzvarianten (SNP Genotypisierung, Alleldiskriminierung)
- Fluoreszenzdetektion (DNA/RNA Quantifizierung)
Schritt 1: Reverse Transkription − RNA effizient und sensitiv in cDNA umschreiben
Die GoScript™ Reverse Transcriptase schreibt Ihre RNA zuverlässig in cDNA um, selbst bei schwierigen Templates. Auch lange und GC-reiche Templates sind kein Problem. Im Test mit vier andere Transkriptasen (SuperScript® II (Invitrogen), SuperScript® III (Invitrogen), Omniscript® (Qiagen), Sensiscript® (Qiagen) war die GoScript™ Reverse Transcriptase vergleichbar oder besser.
Mehr Infos zu GoScript™ Reverse Transcriptase und zum Test »
Der Reaktionsansatz kann direkt für die quantitative PCR eingesetzt werden. Mehr Infos darüber unter "Prinzip der qPCR" auf dieser Seite.
Schritt 2: quantitative PCR − sensitiver Nachweis der cDNA
Im zweiten Schritt detektieren Sie mit dem GoTaq®qPCR Master Mix die cDNA. In dem Mix enthalten ist ein neu entwickelter DNA-bindender Farbstoff. Beim Binden an doppelsträngige DNA (dsDNA) nimmt die Fluoreszenz stärker zu als bei bisher in der qPCR verwendeten DNA-Farbstoffen, wie z.B. SYBR®* Green. Zudem wird die PCR weniger stark inhibiert als mit SYBR® Green*. Die Amplifikation ist effizient, hat niedrige Ct-Werte und einen großen linearen Bereich.
Der Master Mix enthält den CXR-Referenzfarbstoff in geringen Mengen. Sollte das verwendete Instrument höhere Mengen benötigen, ist dem GoTaq® 2-Step RT-qPCR System separat 100x CXR-Referenzbeistoff beigelegt.
In Kombination mit der bewährten GoTaq® Hot Start Technologie und einem optimierten Puffer gewährleistet der GoTaq® qPCR Master Mix eine robuste Real-Time PCR: zuverlässig, reproduzierbar und sensitiv.
Flexibel & Effizient− PCR mit der GoTaq® Hot Start Polymerase
Die GoTaq® Hot Start Polymerase ist an einen Antikörper gebunden. Aktiviert wird sie in einem initialen Hitzeschritt von nur 2 Minuten durch Denaturierung des Antikörpers.
Die optimierte Kombination aus Polymerase und Puffer erlaubt eine hohe Zyklenzahl (45-50 Zyklen) und ist kompatibel mit Programmen, die eine längere Aktivierungszeit (10 Minuten) benötigen. Der GoTaq® qPCR Master Mix ist außerdem mit Fast-cycling-Protokollen kompatibel.
Prinzip der qPCR
Im Gegensatz zur klassischen Endpunkt-PCR wird bei der quantitativen real-time PCR die Zunahme des amplifizierten Produkts direkt beobachtet. Dies geschieht durch Kopplung des Prozesses an Fluoreszenz, die zu jedem Zeitpunkt der Reaktion dektektiert werden kann. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Vergleich der Zeitpunkte (Zyklenzahl, Ct-Wert), an denen die verschiedenen Proben einen willkürlich festgelegten Schwellenwert (im linearen Bereich oberhalb des Hintergrunds) überschreiten. Daraus lassen sich allerdings nur relative Beziehungen zwischen den Proben ableiten (z.B. zum Messen der Induzierung der Expression eines Gens nach Stimulierung der Zellen). Um absolute Werte zu erhalten, muss man die Werte mit einer DNA-Standardreihe vergleichen.
Zur Kopplung der PCR-Reaktion an Fluoreszenz gibt es zahlreiche Möglichkeiten. Beispielsweise die Verwendung von interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen, die eine Zunahme der Fluoreszenz bei Binden an dsDNA zeigen, und beim GoTaq® qPCR Master Mix zum Einsatz kommt.
* SYBR® Green ist eine eingetragene Handelsmarke von Molecular Probes.
** ROX™ ist eine Marke der Applera Corporation.