Produktbeschreibung
Abb. Vergleich mit SYBR® Green** basiertem Produkt:
- kleinere Ct-Werte
- stärkeres Signal
Der GoTaq® qPCR Master Mix ist ein neues Reagenz für die quantitative PCR (qPCR). Das System beinhaltet einen neu entwickelten Farbstoff, der eine stärkere Zunahme in der Fluoreszenz beim Binden an doppelsträngige DNA (dsDNA) aufweist als bisher in der qPCR verwendete DNA-Farbstoffe wie z.B. SYBR®** Green. In Kombination mit der bewährten GoTaq® Hot Start Technologie, einem optimierten Puffer sowie einem neu entwickeltem Referenzfarbstoff gewährleistet der GoTaq® qPCR Master Mix eine robuste real-time PCR mit höchster Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Sensitivität.
Der GoTaq® qPCR Master Mix ist ein 2x konzentrierter fertiger Mix, der bis auf Primer und Template - alle benötigten Komponenten enthält. Er besteht aus dem neu entwickelten DNA bindenden Farbstoff, einem Carboxy-Xrhodamin (CXR) Referenzfarbstoff (identisch mit ROX™**), GoTaq® Hot Start Polymerase, Magnesiumchlorid, dNTPs sowie optimiertem Puffer. Ein Extraröhrchen mit 100x CXR Farbstoff für Instrumente, die höhere Konzentrationen davon brauchen, ist im Kit enthalten (siehe Technical Manual TM318).
** SYBR® Green ist eine eingetragene Handelsmarke von Molecular Probes.
ROX™ ist eine Marke der Applera Corporation.
Eigenschaften
Einfach
Master Mix Format verringert Pipettieraufwand und Kontaminationsgefahr.
Robust
Optimierter Puffer in Kombination mit Hot Start Polymerase sorgt für reproduzierbare Ergebnisse.
Sensitiv
Niedrigere Ct-Werte auch bei niedriger Expression der Zielsequenz
Flexibel
Die GoTaq® Hot Start Polymerase ist an einen Antikörper gebunden, und wird in einem initialen Hitzeschritt von nur 2 min durch Denaturierung des Antikörpers aktiviert. Die optimierte Kombination aus Polymerase und Puffer erlaubt auch eine hohe Zyklenzahl (45-50 Zyklen) und ist kompatibel mit Programmen, die eine längere Aktivierungszeit (10min) benötigen. Der GoTaq® qPCR Master Mix ist außerdem auch mit fast-cycling Protokollen kompatibel.
Neuer Farbstoff
Der neu entwickelte Farbstoff zeigt eine höhere dsDNA-abhängige Fluoreszenzzunahme und weniger PCR-Inhibierung als SYBR®** Green. Daraus resultiert eine effizientere Amplifikation, die zu niedrigeren Ct-Werten und größerem linearen Bereich als bei Verwendung von anderen Farbstoff basierten qPCR-Systemen führt. Zur Detektion werden dieselben Filtersets verwendet wie bei SYBR®** Green und ROX™**.
** SYBR® Green ist eine eingetragene Handelsmarke von Molecular Probes.
ROX™ ist eine Marke der Applera Corporation.
Prinzip der qPCR
Im Gegensatz zur klassischen Endpunkt-PCR wird bei der quantitativen real-time PCR die Zunahme des amplifizierten Produkts direkt beobachtet. Dies geschieht durch Kopplung des Prozesses an Fluoreszenz, die zu jedem Zeitpunkt der Reaktion dektektiert werden kann. Die quantitative Auswertung erfolgt durch Vergleich der Zeitpunkte (Zyklenzahl, Ct-Wert), an denen die verschiedenen Proben einen willkürlich festgelegten Schwellenwert (im linearen Bereich oberhalb des Hintergrunds) überschreiten. Daraus lassen sich allerdings nur relative Beziehungen zwischen den Proben ableiten (z.B. zum Messen der Induzierung der Expression eines Gens nach Stimulierung der Zellen). Um absolute Werte zu erhalten, muss man die Werte mit einer DNA-Standardreihe vergleichen.
Zur Kopplung der PCR-Reaktion an Fluoreszenz gibt es zahlreiche Möglichkeiten. Beispielsweise die Verwendung von interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen, die eine Zunahme der Fluoreszenz bei Binden an dsDNA zeigen, und beim GoTaq® qPCR Master Mix zum Einsatz kommt.