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GoScript™ Reverse Transcriptase
sensitiv
| Im Vergleich |
GoScript™, SuperScript®
II (Invitrogen), SuperScript® III
(Invitrogen), Omniscript® (Qiagen),
Sensiscript® (Qiagen) |
Ausgangs-
material |
totale RNA aus
Mäuseleber |
| Primer |
Random |
| Templates |
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH), Lamin A, Transformation-Related
Protein 53 (trp53) und Cyclin-Dependent
Kinase 9 (cdk9);
sortiert nach Vorkommen |
| Analyse |
2µl der
Synthese-Reaktion mit TaqMan® Real-Time-PCR |
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Ergebnisse |
GAPDH: alle getesteten Reversen
Transkriptasen konnten die GAPDH-RNA einer
einzigen Zelle (entspricht 20pg totaler RNA)
nachweisen
Lamin A: nur GoScript™ konnte im
linearen Bereich RNA einer einzigen Zelle
detektieren
trp53: alle Transkriptasen konnten
nur bis zu zehn Zellen detektieren
cdk9: alle Transkriptasen konnten nur
bis zu 1000 Zellen detektieren (Abb. 1)
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Abb.: GoScript™ zeigt gleiche oder höhere
Sensitivität bei jedem
Transkriptionslevel. Verdünnungsreihe
von Maus RNA in RT Reaktion mit Random
Primern.
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Fazit |
GoScript ist genauso sensitiv wie oder
sensitiver als die getesteten Reversen
Transkriptasen. |
effizient
| Im Vergleich |
GoScript™, SuperScript®
II (Invitrogen), SuperScript® III
(Invitrogen), Omniscript® (Qiagen),
Sensiscript® (Qiagen) |
Ausgangs-
material |
humane totale RNA aus
Darm |
| Primer |
Oligo(dT) und Random |
| Template |
8,9kb Adenomatosis
Polyposis Coli (APC) |
| Inkubationszeit |
50-60min |
| Analyse |
Endpunkt-PCR mit Primern
für eine 940bp Region am 5' Ende des
Transkripts (GoTaq® Green Master Mix) |
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Ergebnisse |
GoScript™ ergab mehr PCR-Produkt als die
anderen Reversen Transkriptasen mit
Oligo(dT)- Primern |
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Abb.: GoScript™ transkribiert effizient
lange RNA-Fragmente. Verdünnungsreihe
von humaner RNA in RT Reaktion mit
Oligo(dT)-Primern.
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Fazit |
GoScript™ erzeugte die längsten
cDNA-Fragmente |
bequem
| Im Vergleich |
GoScript™, SuperScript®
II (Invitrogen), SuperScript® III
(Invitrogen), Omniscript® (Qiagen),
Sensiscript® (Qiagen) |
Ausgangs-
material |
in vitro transkribierte
RNA (1,2kb Kanamycin Positive Control RNA) |
| Primer |
Oligo(dT) |
| Template |
8,9kb Adenomatosis
Polyposis Coli (APC) |
| Inkubationszeit |
50-60min |
| Inhibitoren |
5%, 10%, 20% Ethanol |
| Analyse |
Real-Time-PCR mit GoTaq®
qPCR Master Mix − Differenz zwischen
Ct-Werten mit und ohne Inhibitor |
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Ergebnisse |
Bei
5% Ethanolgehalt wurden die Reversen
Transkriptasen wenig oder kaum beeinflusst.
Bei 10% und 20% wurde GoScript™ am wenigsten
von Ethanol im Reaktionsansatz beeinflusst.
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Abb.: GoScript™ ist robuster gegenüber
erhöhter Ethanolkonzentration.
Verdünnungsreihe von humaner RNA in RT
Reaktion mit Oligo(dT)-Primern.
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Fazit |
GoScript™ ist robuster gegenüber erhöhter
Ethanolkonzentration als die anderen
getesteten Reversen Transkriptasen. |
verlässlich
| Im Vergleich |
GoScript™, SuperScript®
III (Invitrogen)
(Thermostabilität: GoScript™ 42°C;
SuperScript® III 50°C) |
Ausgangs-
material |
humane totale RNA
(HEK293) |
| Primer |
Oligo(dT) |
| Template |
Nocturnin (GenBank
Accession # NM_012118), enthält mehrere
Regionen mit >60% GC-Gehalt |
Inkubations-
temperatur |
42°C oder 50°C |
| Analyse |
Endpunkt und
Real-Time-PCR mit GoTaq® qPCR Master Mix |
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Ergebnisse |
GoScript™ schreibt auch bei 50°C
(Standardtemperatur 42°C) mehr PCR-Produkt
um als SuperScript® III. Beide Enzyme
transkribierten das Vergleichstranskript
alpha-2 Makroglobulin in gleichem Maße. |
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Abb.: GoScript™ Reverse Transcriptase
schreibt schwierige Transkripte
effizienter um als SuperScript® III. A.
Spur 1: Kontrolle (kein Template),
Spur 2: Kontrolle (kein Enzym),
Spur 3: GoScript™ Reverse Transcriptase
Reaktion,
Spur 4: SuperScript® III
Reaktion.
Reaktionstemperatur für
alle Reaktionsansätze 50°C B.
Reaktionstemperatur wie im
Hersteller-Protokoll angegeben.
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Fazit |
GoScript™ Reverse Transcriptase schreibt
schwierige Transkripte effizienter um als
SuperScript® III. |
Ammerschläger, M. et al. Lining Up the Scripts:
Reverse Transcriptase Comparison Study. Promega
Corporation Web site.
www.promega.com/pubs/tpub_029.htm Updated
February 2010. Accessed March 15, 2010.
Die Reverse Transkriptionen wurden jeweils
nach Angaben der Hersteller angesetzt und
durchgeführt, falls nicht anders angegeben.