PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay

Der PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay ist ein Biolumineszenztest zur Bestimmung der zyklischen Nukleotid Phosphodiesterase-Aktivität in aufgereinigten Quellen. Dieser speziell für Hochdurchsatzverfahren konzipierte Test im Multiwell-Format liefert bereits in weniger als einer Stunde die Aktivitäten sowohl cAMP- als auch cGMP-abhängiger Phosphodiesterasen.

Aufgrund ihrer Eigenschaften als Kontrolleure von Second Messenger Signal-Molekülen sind PDE′s bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt und werden auch in Verbindung mit einigen Krankheiten, wie z.B. Asthma, Errektionsstörungen oder Autoimmun-Funktionsstörungen gebracht. Die Auswahl selektiver Inhibitoren von PDE′s haben die Untersuchung der zyklischen Nukleotid-Signalwirkung erleichtert und somit den Weg geebnet, um die Rolle der PDE′s bei zellulären oder Gewebsveränderungen zu erforschen. Der PDE-Glo™ Assay erlaubt es geeignete Inhibitoren aus Bibliotheken zu identifizieren. Hierbei werden Veränderungen der cNMP-Mengen über einen biochemischen Nachweis in Lumineszenz umgewandelt, welche in direktem Zusammenhang mit der PDE-Aktivität steht.

Funktionsprinzip des PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay

Die Bindung von cNMP an das inaktive Proteinkinase A Holoenzym bewirkt über eine Konformationsänderung die Freisetzung seiner katalytischen Untereinheiten, welche dann unter ATP-Verbrauch die übertragung des terminalen Phosphates auf ein Substrat der Proteinkinase A katalysieren. Mit dem Luziferase-basierten Kinase-Glo® Reagenz kann nun die verbleibende Menge an ATP luminometrisch bestimmt werden (vgl. Abb.1). Da PDE cAMP bzw. cGMP zu AMP bzw. GMP hydrolysiert, nimmt die Menge an zyklischem Nukleotid-Monophosphat (cAMP bzw. cGMP) ab. Daher wird weniger Proteinkinase A aktiviert und weniger ATP verbraucht, welches nun für die Luziferase-Reaktion zur Verfügung steht. Daraus resultiert eine gesteigerte Lumineszenz. Diese ist somit direkt proportional zu den verbleibenden ATP-Mengen, welche wiederum direkt proportional zu den Mengen an PDE ist.