Protokolle: Zellbasierte Assays für das Multiplexing

Normalisierung des Reportergensignals in Bezug auf Zellviabilität unter Verwendung des EnduRen™ Live Cell Substrate (Renilla Luciferase, lumineszent) und CellTiter-Glo® Assay (Viabilität, lumineszent)

• Zellen in 90 µl Medium in einer 96-Well Platte ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
• Das EnduRen™ Live Cell Substrate wie im Protokoll TM244 angegeben verdünnen. Pro Well 10 µl EnduRen™ Substrate (60 µM) zugeben und für weitere 2 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubieren. Abhängig von der Toleranz der Zellen gegenüber dem EnduRen™ Substrate können Sie dies vor oder nach der experimentellen Behandlung zugeben.
• Lumineszenz als Maß der Reporteraktivität messen.
• Das gleiche Volumen CellTiter-Glo® Reagent (100 µl/Well) zugeben, für 2 Minuten auf einem Plattformschüttler mischen um Zelllyse zu induzieren, und dann für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um das Lumineszenzsignal zu stabilisieren.
• Lumineszenz wie im Protokoll TB288 beschrieben messen, um die Zellviabilität zu bestimmen.

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Bestimmung der Zytotoxizitätsmechanismen einer Substanz unter Verwendung des CytoTox-ONE™ Assay (LDH Freisetzung, fluoreszent) und Caspase-Glo® 3/7 Assay (lumineszent)

• Zellen in 100 µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
• CytoTox-ONE™ Substrate in 2x Konzentration rekonstituieren und 25 µl/Well zugeben.
• Unter Schütteln 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Protokoll TB306 beschrieben messen, um nekrotische Zellen zu bestimmen.
• Das gleiche Volumen (125 µl) Caspase-Glo® 3/7 Reagent zu jedem Well zugeben.
• Für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um ein Lumineszenzgleichgewicht zu erhalten. Lumineszenz wie im Protokoll TB323 beschrieben messen.

Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass alle Wells nach der Inkubation mit Caspase-Glo® Reagent eine gleichmäßige rosa Farbe haben. Wenn alle Wells die gleiche rosa Farbe haben während die Lumineszenz aufgezeichnet wird, wird das Licht in der gesamten Probe gleichmäßig gequencht, unabhängig von der CytoTox-ONE™ Ausgangsaktivität.

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Bestimmung der Zytotoxizität und Caspase-3/7 Aktivität unter Verwendung des CytoTox-ONE™ Assay (LDH Freisetzung, fluoreszent) und Apo-ONE® Assay (Caspase-3/7 Aktivität, fluoreszent)

• Zellen in 100 µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
• überstand auf eine neue Platte transferieren und CytoTox-ONE™ Reagent zugeben, um LDH-Freisetzung als Indikator für nekrotische Zellen zu bestimmen.
• Inkubieren und Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Protokoll TB306 beschrieben messen.
• Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Reagent zu den Zellen in der ursprünglichen Platte zugeben und für 1-4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
• Apo-ONE® Assay Fluoreszenz (485Ex/527Em) wie im Protokoll TB295 beschrieben messen.

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Bestimmung der Reporteraktivität und Caspaseaktivität unter Verwendung des EnduRen™ Live Cell Substrate (Renilla Luziferase, lumineszent) und Apo-ONE® Assay (Caspase-3/7 Aktivität, fluoreszent)

• Zellen in 90 µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
• Das EnduRen™ Live Cell Substrate wie im Protokoll TM244 angegeben verdünnen. Pro Well 10 µl EnduRen™ Substrate (60 µM) zugeben und für weitere 2 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ inkubieren. Abhängig von der Toleranz der Zellen gegenüber dem EnduRen™ Substrate können Sie dies vor oder nach der experimentellen Behandlung zugeben.
• Lumineszenz messen.
• Das gleiche Volumen Apo-ONE® Reagent (100 µl/Well) zugeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
• Fluoreszenz (485Ex/527Em) wie im Protokoll TB295 beschrieben messen.