Simultanes Multiplexing

Simultan = Zugabe von mehr als einem Reagenz zu derselben Probe im homogenen Format.

Multiplexing zur Detektion von Initiator- und Effektor-Caspasen

Ein Beispiel für das simultane Multiplexing stellt die Kombination von einem lumineszenten und einem fluoreszierenden Apoptose Assay dar.

Caspase-Glo® Assays messen Caspaseaktivitäten unter Verwendung eines luminogenen Caspase-Substrats und einer thermostabilen Ultra-Glow™ Luciferase.
Das Caspase-Glo® Reagenz lysiert hierbei zunächst die Zellen. Aktivierte Caspasen spalten das enthaltene luminogene Caspase-Substrat, Aminoluciferin wird bei dieser Reaktion freigesetzt und durch die Ultra-Glow™ Luciferase umgesetzt. Das dabei entstandene Lumineszenzsignal ist proportional zur vorhandenen Caspaseaktivität.
Derzeit stehen Caspase-Glo® Assays für die Messung von Caspase-3/7, Caspase-8, und Caspase-9 Aktivitäten zur Verfügung.

Die Kombination der Caspase-Glo® 8 oder 9 Assays mit dem Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay ermöglicht in einem Ansatz zusätzlich die Bestimmung von Effektor-Caspasen (Protokoll »). Der Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay verwendet ein profluoreszentes Caspase-3/7 Substrat, um die aktive Caspasen-3 bzw -7 zu bestimmen. Die Menge des entstandenen Fluoreszenzsignals ist proportional der in der Probe vorhandenen Menge an aktiven Caspase-3/7.

Anwendungsbeispiel

Caspaseaktivitäten nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit rTrail: Multiplexing von lumineszentem Caspase-8 mit fluoreszentem Caspase-3/7 Assay

Jurkat Zellen wurden ausgesät und alle 60 Minuten (über einen Zeitraum von 10h) mit 100ng/ml rTRAIL stimuliert. Kontrollzellen wurden mit 10% FCS in RPMI 1640 behandelt. Zur Bestimmung der Caspaseaktivitäten wurde anschließend pro Well 1 Volumen Caspase-Glo® 8 Reagenz zugegeben, in dem auch Apo-ONE® Caspase-3/7 Substrat gelöst war. Nach 1h Inkubation erfolgte die Lumineszenz-Messung der Caspase-8 Aktivität und die Fluoreszenz-Bestimmung (485Ex/530Em) von Caspase-3/7 Aktivität. Der Versuch zeigt die Wirkung von rTRAIL auf Initiator- (Caspase-8) und Effektor-Caspasen (Caspase-3/7).
Die simultane Detektion beider Caspasen ermöglicht in einem Schritt, das Aktivierungsprofil zu analysieren und abzubilden.

Weitere Informationen zu:
Caspase-Glo® 3/7 Assay
Apo-One® Homogeneous Caspase-3/7 Assay

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Protokoll zur Bestimmung der Initiator- und Effektor-Caspaseaktivität
unter Verwendung des Caspase-Glo ® 8 oder 9 Assay (lumineszent) und Apo-ONE® Assay (Caspase-3/7 Aktivität, fluoreszent)

1. Zellen in 100 µl Medium in einer 96-Well Platte (schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten Substanz behandeln.
2. Caspase-Glo® 8 oder 9 Assay Reagent vorbereiten. Apo-ONE® Substrate auftauen und zu dem Caspase-Glo® 8 oder 9 Reagent in einer 1:200 Verdünnung zugeben (50 µl/10ml Caspase-Glo® Reagent). Der Apo-ONE® Buffer wird bei diesem Assay nicht verwendet. Zu jedem Well das gleiche Volumen (100 µl) zugeben.
3. Für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Lumineszenz wie im Technischen Protokoll Nr. TB332 oder TB333 beschrieben messen als Indikator der Caspase-8 oder Caspase-9 Aktivität.
4. Fluoreszenz (485Ex/527Em) des Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay wie im Technischen Protokoll Nr. TB295 beschrieben messen als Indikator der Caspase-3 Aktivität.

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