Sequenzielles Multiplexing
Sequenziell = Kombination nicht-kompatibler
Assaychemie: zwei verschiedene Assays werden
zeitversetzt in derselben Probe durchgeführt.
Bestimmung der Zellviabilität und des
Zelltod-Mechanismus
Diese erfolgt zeitversetzt in derselben Probe. Die
Messung der Zellviabilität erfolgt mit Hilfe des
CellTiter-Blue® Cell Viability Assays, der die
Anzahl lebender Zellen in einer Zellkultur durch
Messung des Reduktionspotentials bestimmt. Das
CellTiter-Blue® Reagenz enthält Resazurin, welches
durch metabolisch aktive Zellen in Resorufin
umgewandelt wird. Das entstehende Fluoreszenzsignal
ist direkt proportional zur Zahl der lebenden
Zellen.
Zum zusätzlichen Nachweis des Zelltodmechanismus
kann der CellTiter-Blue® Assay durch Multiplexing
sowohl mit dem Caspase-Glo® 3/7 Assay (lumineszent)
als auch mit dem Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7
Assay (fluoreszent) kombiniert werden (Protokolle
»).
Anwendungsbeispiel
Zellviabilität und Caspaseaktivität nach
Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen
des Apoptoseinduktors Staurosporin
Jurkat Zellen wurden mit unterschiedlichen
Staurosporin Konzentrationen behandelt. Das
CellTiter-Blue® Reagenz wurde unmittelbar nach
Zugabe der Testsubstanz zu den Zellen pipettiert, 5
Stunden inkubiert und die Fluoreszenz bei
560Ex/590Em gemessen. Die Aktivität der Caspasen
wurden durch Zugabe von 120 µl Apo-One® Homogeneous
Caspase 3/7 Assay Reagenz zu der gleichen Probe
detektiert. Die Zellen wurden eine weitere Stunde
inkubiert und anschließend die Fluoreszenz
(485Ex/527Em) gemessen.
Weitere Informationen zu:
CellTiter-Blue® Cell Viability Assay
Caspase-Glo® 3/7 Assay
Apo-One® Homogeneous Caspase-3/7 Assay
Protokoll zur Bestimmung der Zellviabilität
und des Mechanismus
des Zelltodes unter Verwendung von
CellTiter-Blue® Assay (Viabilität, fluoreszent) und
Apo-ONE® 3/7 Assay (fluoreszent)
1. Zellen in 100 µl Medium in einer 96-Well Platte
(schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten
Substanz behandeln.
2. Während der letzten 1-2 Stunden der Behandlung
mit der Testsubstanz 20 µl/Well CellTiter-Blue®
Reagent zugeben und bei 37°C inkubieren.
3. Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Technischen
Protokoll Nr.
TB317 beschrieben messen, um die Zellviabilität
zu bestimmen.
4. Das gleiche Volumen (120 µl) Apo-ONE® Homogeneous
Caspase-3/7 Reagent zugeben und für 1-4 Stunden bei
Raumtemperatur inkubieren.
5. Fluoreszenz (485Ex/527Em) wie im Technischen
Protokoll Nr.
TB295 beschrieben messen, um die
Caspaseaktivität als Apoptosemarker zu bestimmen.
Protokoll zur Bestimmung der Zellviabilität
und des Mechanismus des Zelltodes unter Verwendung
von CellTiter-Blue® Assay (Viabilität, fluoreszent)
und Caspase-Glo® 3/7 Assay (lumineszent)
1. Zellen in 100 µl Medium in einer 96-Well Platte
(schwarz oder weiß) ziehen und mit der gewünschten
Substanz behandeln.
2. Während der letzten 1-2 Stunden der Behandlung
mit der Testsubstanz 20 µl/Well CellTiter-Blue®
Reagent (1:4 verdünnt in Dulbecco's™ PBS) zugeben
und bei 37°C inkubieren.
3. Fluoreszenz (560Ex/590Em) wie im Technischen
Protokoll Nr.
TB317 beschrieben messen, um die Zellviabilität
zu bestimmen.
4. Das gleiche Volumen (120 µl) Caspase-Glo® 3/7
Reagent zu jedem Well zugeben und für 1 Stunde bei
Raumtemperatur inkubieren, um ein
Luziferasegleichgewicht zu erreichen.
5. Lumineszenz wie im Technischen Protokoll Nr.
TB323 beschrieben messen, um die
Caspaseaktivität als Apoptosemarker zu bestimmen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass alle Wells nach
der Inkubation mit Caspase-Glo® Reagent eine
gleichmäßige rosa Farbe haben. Wenn alle Wells die
gleiche rosa Farbe haben während die Lumineszenz
aufgezeichnet wird, wird das Licht in der gesamten
Probe gleichmäßig gequencht, unabhängig von der
CellTiter-Blue® Ausgangsaktivität.
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